7+线粒体+分型+机器学习+实验验证，干湿结合助力线粒体相关基因分析，事半功倍！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“MTFR2-dependent mitochondrial fission promotes HCC progression”，这篇文章发表在J Transl Med期刊上，影响因子为7.4。

结果：

HCC中线粒体动态基因的特征

在23个线粒体动态基因中，21个基因（DNM1L、MTFR2、ARL2、MFN1、MIGA1、MIGA2、MTCH2、OMA1、OPA1、PLD6、ARMC10、FIS1、MFF、MIEF1、MIEF2、MTFP1、MTFR1、MUL1、RAB24、SLC25A46、SPIRE1）在HCC组织中较正常显著上调，其表达水平的热图如图所示。2一个。DEGs的共表达网络显示MTFR2和DNM1L的表达水平呈正相关（图1）。2以及由这 21 个 DEG 编码的这些蛋白质之间的相互作用如图所示。2C.

线粒体动态基因的共识聚类确定了两组具有不同病理特征、线粒体状态和临床预后的HCC患者

根据已知动态基因的表达，当k = 2时观察到“最干净”的聚类（图1）。3A-H）。当k = 2时，簇在组内的相关性最高，组间干扰最小（图1）。3I，J）。因此，HCC患者被分为两个亚簇：Cluster1（n = 219）和Cluster2（n = 146）。KM曲线对Cluster1患者具有显著的生存优势（P = 0.003，图1）。3L），大多数DEGs在Cluster2中高度表达，如热图所示（图1）。3M，附加文件2：表S2）。此外，服务器等级较高的HCC患者在Cluster2中更为明显（P < 0.01），而其他临床病理特征在两个亚簇之间无显著差异（图1）。3在聚类2中，病理3级患者占总数的近一半（图1）。3当阈值更改为 |log2FC|>0.7，在23个线粒体动态基因中，只有DNM1L和MTFR2被证明可以促进线粒体裂变，在两个亚组之间表达显著差异（图1）。3O，附加文件2：表S3），表明线粒体的形态更倾向于在Cluster2中显示为裂变。GO和KEGG的结果进一步显示，Cluster2更可能涉及线粒体裂变和细胞周期途径（图1）。3先前的研究表明，DNM1L在线粒体裂变中起着重要作用，而MTFR2作为DNM1L的上游，诱导线粒体裂变[39,40]。基于此，可以合理地将两个簇之间的DEGs鉴定为线粒体动力学相关基因，并推测MTFR2/DNM1L相关线粒体裂变与较差的分化等级和预后之间存在较强的相关性。

构建包含十个选定的线粒体相关基因的风险特征

通过单因素Cox回归分析从2143个DEGs中选出775个基因，符合P<0.05的标准，并进行了进一步分析（附加文件2：表S2，S4）。进行LASSO回归分析，根据最佳λ值构建10个基因特征（图1）。4A，B）。风险评分的计算方法见表2.

风险特征的多组学验证

生成ROC曲线以评估预后模型的预测敏感性和特异性。结果显示，风险评分的AUC为0.773，其次是年龄和性别的AUC。此外，1 年生存期的 AUC 分别为 0.773、3 年生存期和 5 年生存期的 AUC 分别为 0.773 和 0.703（图 1）。4C，D）。在综合预后预测中，与其他年龄和阶段特征相比，该特征在C指数中具有优势（图1）。4生存状态显示在KM曲线中（图1）。4F），表明高危组患者的预后比低危组患者差（每个基因的KM曲线显示在附加文件1：图S1中）。HCC患者的生存状态和风险评分曲线显示，HCC患者的风险评分与死亡人数成正比（图1）。4F-I）。结合 PCA 和 t-SNE 预测（图 1）。4J，K），风险模型对两组风险评分具有可靠的聚类能力。热图显示，高危组模式基因表达上调（图1）。4风险评分被指示为能够通过单因素Cox回归分析预测生存率低的独立因素。多变量分析显示，在调整其他混杂因素后，风险评分是预后因素（图1）。4M，N）。建立列线图以促进预后预测（图1）。4O），其高灵敏度和准确性通过校准曲线得到证明（图1）。4P).

通过功能富集分析评估线粒体状态

PCA结果显示，低危组和高危组各基因表达无显著差异（图1）。5然而，预后特征中使用的10个线粒体动力学基因的划分存在显着差异（图1）。5此外，根据10基因模型的患者区室化结果与基于线粒体裂变基因的区室化结果高度一致，而根据线粒体融合基因的患者区室化结果高度相反（图1）。5C，D）。事实上，线粒体动态基因与模型基因之间表达水平的相关性如图所示。5E，然后可视化相关网络（图1）。5MTFR2被认为是裂变基因，与风险特征基因强有力地正向共表达，在用11种拓扑分析筛选后被鉴定为枢纽基因（附加文件2：表S5）。此外，10个模型基因与MTFR2的显著共表达如热图所示（图1）。5G).

免疫浸润、TMB、TSI 和免疫治疗反应的评估

由于 HCC 进展、线粒体动力学和免疫浸润之间存在内在和密切的联系14，基于七种算法的免疫细胞热图如图所示。6A，表明风险评分与HCC中的免疫细胞浸润相关。此外，免疫检查点在高危人群中表现出显著更高的表达（图1）。6在筛选特定检查点后，高危组患者表现出CD274（程序性死亡配体1，PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）的表达优异。作者在两个风险组中观察到相似的TMB（图1）。6C），而TP53是所有患者中最常见的基因改变，高危组患者携带高TP53突变，其次是RB1（图1）。6H-J）。此外，图。6E显示高TMB与较差的预后相关，而图。6F表示风险评分和TMB的组合;患者被分为4组，预后明显不同（P < 0.001）。高危组的TIDE评分显著低于低危组（图1）。6D），提示高危组患者对ICB治疗反应较好。接下来，计算癌症干性指数，结果显示干性指数与风险评分呈正相关（图1）。6G).

线粒体状态和蛋白质表达的验证

上述分析表明，MTFR2和DNM1L表达水平较高的线粒体裂变与较差的预后有关。为了进一步阐明线粒体形态，使用了TEM，TEM图像证实了线粒体形态在邻近组织中显示出融合和裂变的平衡（图1）。7A），而HCC组织中的线粒体状态是裂变的，反映在线粒体的萎缩和碎片化中（图1）。7H&E染色（图1）。7C、D）和免疫组化染色（IHC）（图1）。7E-H）显示，HCC组织中MTFR2和DNM1L的蛋白表达高于邻近组织。体外进一步证实了HCC中MTFR2和DNM1L的表达水平上调，蛋白质印迹结果中的条带较暗（图1）。8A、B）和免疫荧光图像中更强的免疫荧光信号（图1）。8此外，还发现了位于细胞质中的MTFR2和DNM1L的存在，如图1所示。8C.