Nature亮点 | 利用3000万启动子深度学习昭示基因调控序列进化之“神谕”——在解码基因调控法则的努力上迈出了一大步

撰文 | 伊凯

责编 | 兮

基因及其表达模式是表征和决定细胞状态的基础，因而基因表达的调控机制也是分子生物学研究的核心大课题之一。在基因调控的多个层级中，转录调控（transcriptional regulation）是最早受到关注和研究得最为透彻的分支。经过数十年的研究，人们已经知道，在原核和真核生物中，基因转录水平的决定因素都包括顺式调控元件（cis-regulatory element）和反式作用因子（trans-acting factor）两大要件【1,2】。在转录调控的语境下，前者主要由启动子、增强子和沉默子等非编码DNA序列构成；而后者则包含RNA聚合酶、转录因子、染色质重塑因子（chromatin remodeler）、甚至是一些RNA结合蛋白（RNA binding protein, RBP）等【3】。

尽管从研究范式上考虑，顺式元件和反式因子可以被认为在基因转录调控中各自做出独立贡献，因而获得同等的重视。但就生物机制的前后逻辑而言，顺式元件所蕴含的内在序列特征（intrinsic sequence pattern）往往直接决定了反式因子的结合与作用模式。一个经典的例子是，由ChIP-seq测定的人与小鼠肝细胞关键转录因子HNF1α、HNF4α和HNF6虽然具有几乎完全保守的DNA结合域，但却在两类物种间表现出极为不同的全基因组结合模式；然而，当研究者将人类21号染色体转入小鼠肝细胞后，却发现小鼠细胞的上述因子表现出与人同源因子几乎一致的对外源人DNA序列的结合模式；因而证实了小鼠与人之间转录因子的结合模式差异并不来自于因子本身或细胞整体环境的差异，而是几乎由物种间DNA同源序列的变异所决定【4】。

当然，这并不意味着基因调控的根本逻辑是“序列决定论”：毕竟，拥有同一套DNA序列的不同组织和细胞类型、不同生理和病理条件，往往表现出高度差异化的基因调控模式。即使将各类表观遗传修饰差异，如DNA甲基化、染色质开放性等考虑进去，作为概念延展后的顺式元件，也不能完全预测和解释基因调控的多样性。也即是说，反式因子在不同生物场景下的差异性行为仍然是形塑异质化基因调控的重要元素，只不过它并非基于一个独立于顺式元件自行作用的逻辑，而是类似于“鸡”与“蛋”的相辅相成的复杂逻辑【5】。

因此，对各类顺式调控元件所遵循的序列逻辑的解析就显得极为重要。通常，这类信息可以由共识序列（consensus sequence）、结合基序（binding motif）和位置权重矩阵（position weight matrix）等形式表征。虽然这些方法在大致判断顺式元件的激活程度或反式因子结合模式方面具有一定的效果，但它们所容纳的信息量少，且灵活性差，无法用来精准预测顺式元件的行为。

近年来，深度学习技术的飞速发展带动了多个现实领域的革命性变化。由图灵奖（ACM A.M. Turing Award）获得者Yann Lecun最初于1989年提出的卷积神经网络（convolutional neural network, CNN）【6】及其多种变体，凭借精妙的模仿人类视觉认知层级结构设计的卷积（convolution）和池化（pooling）与非线性激活配合的算法特征，在计算机视觉（computer vision）的多个子领域的重要问题上（如人脸识别、图像语义分割、目标追踪和视频分类等）都取得了最好性能。与基于短序列匹配的传统方法相比，机器学习和深度学习方法由于具有强大的模式提取（pattern extraction）能力，极大地提升了对顺式元件内在序列特征的认知能力，因而生物学领域内被广泛运用至DNA/RNA-蛋白互作【7】、DNA甲基化【8】、染色体可接近性【9】、蛋白质结构预测【10】等问题中。

对启动子和增强子等非编码序列所遵循的内在调控逻辑的解析，不仅仅有着前述所说的显而易见的“现实意义”，更承担了连接分子进化长河中的转录调控的“过去与未来”的重大责任。这是因为，只要人们掌握了基因调控序列与基因表达水平之间的映射关系，就能够从进化适应性（fitness）角度对这些序列的进化历史进行解释，进而对其面对当下特定生存环境的未来走向或者满足人为需求的合成方向进行预测，甚至直接进行规定。在这个意义上，理解了基因调控序列的编码逻辑，就是领会了基因调控的“神谕”。

2022年3月9日，来自美国麻省理工学院的Aviv Regev课题组在Nature杂志上发表了题为The evolution, evolvability and engineering of gene regulatory DNA的研究，报道了基于大规模荧光基因报告检测数据所训练的DNA序列深度神经网络在预测和解释酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）基因启动子的进化潜力方面的优秀表现，在解码基因调控法则的努力上迈出了一大步。

与蛋白质编码序列的适应性图景（fitness landscape）在相当大的程度上直接取决于突变是否导致氨基酸改变（同义突变 vs. 非同义突变）相比，对非编码区域的适应性的测定就显得复杂和困难得多。这是因为，这些区域的进化适应性往往是通过对下游靶基因的表达水平的调控强度所间接传递的，而后者只能够通过精密的分子生物学测定得到，而非基于任何类似于密码子规则的简单规则所能判定。所幸的是，以大规模并行报告基因检测（massive parallel reporter assay, MPRA）为代表的高通量基因表达遗传扰动因素筛选方法在近年来取得了规模和精度上的重大突破，为实现测量基因调控序列变异对靶基因表达水平的影响提供了坚实的方法学基础。

基于此，该研究的作者首先合成了超过3000万个携带长度为80个碱基的随机酵母启动子序列，然后嵌入同一含有YFP荧光基因的报告系统中，并经由培养于特定营养条件中的酵母细胞的表达系统进行转录激活，最后以YFP荧光强度作为某一启动子序列激活靶基因强度的表征（下图）。

在获得了关于酵母启动子序列对其激活程度影响的大规模筛选数据之后，作者考虑利用深度学习方法构建一个能够将启动子序列的内在特征进行精准识别和提取，并映射至对应激活程度的预测模型。经过一系列对比，作者发现最为常见的卷积神经网络就能够很好地实现这一目的，因其在独立测试集上所预测出的转录强度与真实值具有高达0.96的相关系数，且呈极佳的线性关系。在基于不同营养条件培养基的细胞内转录系统中所产生的数据上重复这一模型构建，依然获得了相当良好的预测精度和复现性。因此，这一卷积神经学习模型不仅能够实现对未知酵母启动子序列的转录强度的精准预测，更重要的是，其在预测任务上的极佳表现直接反映了与转录强度相关的启动子本身的内在序列特征的存在性。

基于这一强大的启动子序列转录效应预测模型，作者进而从基因调控的分子进化角度对多个根本问题进行了丰富的探索。例如，作者试图理解三种常见分子进化模式在调整启动子转录效应上的具体表现，即随机遗传漂变（genetic drift）、稳定选择（stabilizing selection）和定向选择（directional selection）。为此，作者运行了一系列由上述预测模型打分作为输出判定的遗传算法迭代，对启动子序列进行进化模拟。具体而言，作者分别以基底转录水平极高、极低或处于一般层次的启动子序列起始，随机导入单核苷酸突变，然后在每一子代中选取符合规定遗传模式的启动子集，如在稳定选择模式下就选择表达水平与亲代接近的，依此循环。结果发现，那些基底激活水平处于极端层次的启动子，在少量依据稳定遗传模式进行的突变迭代后就能够较快地离开极端位置，而趋于一般激活水平；类似地，那些最初转录水平较为适中的启动子，在依据定向遗传模式进行的突变迭代中也能很快的到达高和低的极端位置。最后，这些结果均能够得到报告基因筛选的实验结果验证。因此，这一遗传进化模拟实验不仅令人信服地揭示了基因调控序列很高的进化适应度，同时也展示了基于DNA序列的深度学习模型在解释序列进化历史方面的极佳性能。

在该研究中，另一个很好地展示了深度学习模型在解码基因调控序列编码逻辑方面的强大效力的案例是，作者成功地实现了对这些序列依据进化潜力和进化模式特征的相似性进行降维和可视化，并发现了三个独立而互补的能够共同解释这些进化特征的差异性的“原型”（archetype）。具体而言，对于每一个启动子序列，作者首先将单个碱基由字母表示转变为其所对应的其余三个可能变异所导致的由深度学习模型所预测的转录效应扰动强度预测值，然后对这些预测值进行简单排序，形成一个长度为原启动子三倍的连续值向量，最后将其作为输入通过自编码器（autoencoder，一种常用于降维分析的深度神经网络变体）进行特征提取，得到二维水平的坐标值。

尽管用自编码器对生物序列进行降维处理并非新事物，但上述处理的创新之处在于其摒弃了以往的“相似的序列导致相似的表型”的简单逻辑，从而避免了采用one-hot encoding的特征编码方式，而是加入了一层基于序列——转录神经网络所规定的编码逻辑对序列首先进行独特的特征转换，因此确保了降维结果表征的是进化潜力和进化特征方面的相似性，而非单纯的序列本身的相似性。

的确，当上述降维特性得以确保时，作者成功发现了以往所未曾被揭示过的关于基因调控序列进化模式的基本原则，也即是三种进化模式的“原型”：局部表达水平极大化（local expression minimum）、局部表达水平极小化（local expression maximum）、和整体表达可塑性（malleable expression）。第一种原型的含义是启动子序列中绝大多数碱基的突变都不会带来对转录调控水平的显著影响，而只有极少数位置具有通过突变增强转录效应的潜力；第二种原型与第一种相同，只不过突变会降低转录效应，而非增强；最为特殊的是第三种原型，即启动子序列内各个区域都具有一定程度的通过突变来扰动转录调控效应的潜力，故此称为整体表达可塑性原型。显然，这一三原型模式的本质就是对任何基因调控序列的进化潜力和进化模式的高度总结和精准预测的基础。

总之，这一研究不仅在方法论上结合了分子生物学和计算生物学的两大前沿技术——大规模并行报告基因检测和基于序列的深度学习模型，更是在科学思想上借由分子进化理论超越了对“实然”（“现在”）的描述，而达到了连接过去与未来，贯通解释与预测的对“应然”进行阐释的境地。它发掘出了基因调控编码的多项基本逻辑，具有分子生物学和进化生物学方向上的极为广泛的普遍意义。

在同期，University of Zurich的Andreas Wagner发表了News & Views文章An oracle for gene regulation。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04506-6

https://www.nature.com/articles/d41586-022-00384-0

参考文献

1.Lee, T. I. & Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell 152, 1237–1251 (2013).

2.Andersson, R. & Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nat. Rev. Genet. 21, 71–87 (2020).

3.Xiao, R. et al. Pervasive Chromatin-RNA Binding Protein Interactions Enable RNA-Based Regulation of Transcription. Cell 178, 107-121.e18 (2019).

4.Wilson, M. D. et al. Species-specific transcription in mice carrying human chromosome 21. Science (80-. ). 322, 434–438 (2008).

5.Zeitlinger, J. Seven myths of how transcription factors read the cis-regulatory code. Curr. Opin. Syst. Biol. 301, 127065 (2020).

6.LeCun, Y. et al. Backpropagation Applied to Handwritten Zip Code Recognition. NeuralComput. 1, 541–551 (1989).

7.Alipanahi, B., Delong, A., Weirauch, M. T. & Frey, B. J. Predicting the sequence specificities of DNA- and RNA-binding proteins by deep learning. Nat. Biotechnol. 33, 831–838 (2015).

8.Angermueller, C., Lee, H. J., Reik, W. & Stegle, O. DeepCpG: Accurate prediction of single-cell DNA methylation states using deep learning. Genome Biol. 18, 15–22 (2017).

9.Kelley, D. R., Snoek, J. & Rinn, J. L. Basset: Learning the regulatory code of the accessible genome with deep convolutional neural networks. Genome Res. 26, 990–999 (2016).

10.Senior, A. W. et al. Improved protein structure prediction using potentials from deep learning. Nature 577, 706–710 (2020).

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