5+机器学习+实验验证+免疫浸润，可谓是非肿瘤生信结合实验验证的范文，值得收藏！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Bioinformatic analysis of related immune cell infiltration and key genes in the progression of osteonecrosis of the femoral head”，这篇文章发表在Front Immunol期刊上，影响因子为5.7。

结果：

分析mRNA的转录组学特征

为了探讨ONFH对软骨下骨的影响，作者利用基因芯片分析了从ONFH患者和对照患者获得的软骨下骨组织中的mRNA表达谱。上述表达谱数据和GSE 74089表达谱数据都经过标准化程序。使用R包“sva”缓解批次效应，结果如图1所示。DE mRNA的识别标准设定为log 2|倍数变化|≥ 2.0和P < 0.05。总共鉴定了107个DE mRNA，包括76个下调和31个上调的转录本。如图2所示，采用分层聚类来可视化样品中DE mRNA的独特表达模式。

富集分析结果作者通过整合来自软骨样品的表达谱数据，对ONFH的基础机制进行了彻底的研究

为了阐明与ONFH相关的骨软骨损伤有关的DE mRNA的生物学功能，作者对鉴定的107种DE mRNA进行了包括GO和KEGG富集评估的分析。GO分析揭示了基于GO的DE mRNA的主要功能，在各种功能类别中观察到富集，如细胞迁移、成骨细胞分化、软骨发育、细胞外区域、细胞外基质、钙离子结合、β受体结合和其他相关条目（图3A）。从KEGG数据库中鉴定的富集途径主要包括唾液分泌、金黄色葡萄球菌感染、糖尿病并发症中的AGE-beta信号传导途径和其他相关途径（图3B）。在DE mRNA上进行GSEA后，图3C中显示了途径的显著差异，例如戊糖和葡糖醛酸相互转化、造血细胞谱系和核糖体。

关键基因筛选

机器学习算法用于进一步筛选表达的关键基因。将107个差异表达基因的表达谱数据输入LASSO回归和SVM-RFE模型。LASSO回归，实施10倍交叉验证以优化错误率，辨别出11个特征基因：APOD、CFHR 3、CSN 1 S1、FBXO 43、HBEGF、HLA-B1、INSM 1、LRP 12、MRPS 2、POLE和SFTA 3（图4A、B）。同时，SVM-RFE模型鉴定了8个特征基因：ZW 10、LRP 12、LYZL 6、APOD、IFI 6、EDN 3、FBXO 43和AMY 2B（图4C）。通过两种算法选择的特征基因的交叉导致APOD、LRP 12和FBXO 43作为关键特征基因的明确鉴定（图4D）。为了验证该基因的诊断预测价值，采用ROC曲线分析。在测试集（GSE 7116）中，当APOD、LPR 12和FBXO 43被拟合为一个变量时，诊断效率达到较高水平（AUC = 0. 05）。964，95%CI = 0.904 - 1.000）（图5A-D）。提示APOD、LPR 12和FBXO 43在ONFH与健康对照组的鉴别诊断中具有较好的价值。

DE mRNA的qRT-PCR验证

为了验证微阵列数据的可靠性，作者使用qRT-PCR定量4名ONFH患者和4名对照患者中的APOD、LPR 12和FBXO 43表达。qRT-PCR结果显示关键基因的表达水平与微阵列分析结果一致（图6）。

关键基因与hBMSCs成骨分化的关系

为探讨关键基因与成骨表型形成的关系，采用qRT-PCR和碱性磷酸酶（ALP）染色方法，分别对成骨诱导组和正常组培养3、7、14 d的BMSC进行分析。ALP染色结果显示，ALP活性在成骨诱导过程中逐渐增加（图7A、B）。同时采用qRT-PCR检测成骨相关基因。与对照组相比，成骨细胞组相关基因的表达水平显著升高（P< 0.05）。此外，在成骨的第3、7和14天，成骨组中的APOD表达水平显著高于对照组中的APOD表达水平，但两组之间的FBXO 43和LRP 12没有统计学显著差异（图7 C-E）。

免疫细胞浸润分析

利用CIBERSORT算法分析ONFH患者和对照组的微阵列数据中的免疫细胞浸润模式。条形图说明了所有样品中22种不同免疫细胞类型的百分比（图8A）。值得注意的是，与健康对照相比，ONFH患者表现出较低水平的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞M2和活化的树突状细胞，同时静息的树突状细胞水平升高（图8B）。相关分析显示静息树突状细胞与中性粒细胞（r= -0.46）、单核细胞（r= -0.47）、静息树突状细胞（r=-0.42）、巨噬细胞M2（r= -0.11）呈负相关。相反，在活化的树突状细胞与中性粒细胞（r= 0.83）、单核细胞（r= 0.59）以及巨噬细胞M2（r= 0.28）之间观察到正相关（图8 C）。

总之，确定了免疫浸润的明显差异。此外，APOD显示与中性粒细胞（r= 0.778，P< 0.001）、活化的树突细胞（r= 0.689，P= 0.003）和单核细胞（r= 0.732，P= 0.001）正相关，同时证明与静息的树突细胞负相关（r=-0.540，P= 0.031）（图9A）。LRP 12表现出与巨噬细胞M0的正相关性（r= 0.522，P= 0.037），同时证明与中性粒细胞（r=-0.808，P< 0.001）、单核细胞（r=-0.736，P= 0.001）和活化的树突状细胞（r=-0.629，P= 0.009）和巨噬细胞M2（r=-0.566，P= 0.022）的负相关性（图9 B）。FBXO 43表现出与嗜中性粒细胞（r= 0.801，P< 0.001）、活化的树突状细胞（r= 0.661，P= 0.005）、单核细胞（r= 0.652，P= 0.006）和巨噬细胞M2（r= 0.605，P= 0.013）的正相关性，同时证明与静息的树突状细胞（r=-0.502，P= 0.047）和巨噬细胞M0（r=-0.503，P= 0.046）的负相关性（图9 C）。总之，APOD、LRP 12和FBXO 43均与免疫细胞相关。

总结

在整合数据集后，Limma方法揭示了107个DEG，包括76个下调基因和31个上调基因。富集分析显示这些DE mRNA与细胞迁移、成骨细胞分化、软骨发育和细胞外区等功能密切相关。机器学习算法进一步将APOD、FBXO 43和LRP 12确定为关键基因。ROC曲线表明这些基因的高诊断效率。qRT-PCR结果显示关键基因的表达水平与芯片分析结果一致。体外实验结果表明，APOD与BMSC的成骨分化密切相关。免疫浸润分析提示ONFH与中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞M2、树突状细胞活化和静息状态的失衡密切相关。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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