今天来学习一篇发表在 Cancer Cell 杂志（IF=48.8）上的文献，于2022年12月12日发表，标题为《High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer》，通讯作者Andreas Pircher，Zlatko Trajanoski。

这篇文献是一篇极其典范的单细胞python流派的数据分析文章，集合了单细胞数据预处理，数据合并，数据整合，数据注释等工作。跨数据集和大数据量！应该有很多细节值得学习，更特别的是注释工作，做这样的一个大数据量的图谱类细胞类型注释，可以看看里面到底是如何处理各种分析细节的！

数据和代码

文章的数据队列，基本上都可以下载。提供的数据在这里：

Processed input data：https://doi.org/10.5281/zenodo.6411867

可复现的代码：https://github.com/icbi-lab/luca

提供了清晰的分析步骤：

下游分析：

代码一撇：

看一个脚本：

# ---
# jupyter:
#   jupytext:
#     formats: ipynb,py:light
#     text_representation:
#       extension: .py
#       format_name: light
#       format_version: '1.5'
#       jupytext_version: 1.6.0
#   kernelspec:
#     display_name: Python [conda env:.conda-scanpy_2020-12]
#     language: python
#     name: conda-env-.conda-scanpy_2020-12-py
# ---

import scanpy as sc
import pandas as pd
from glob import glob
from pathlib import Path
import re
import scipy.sparse
from multiprocessing import Pool
import anndata

filenames = glob(


    
"../../data/11_own_datasets/batch1_3patients/processed/*.csv")

meta = pd.read_excel("../../tables/patient_table_batch1_3_patients.xlsx", engine="openpyxl", skiprows=1, skipfooter=1)

meta.rename(columns={"Tumornummer": "tumor_id", "Patient": "patient", "Alter": "age", "Geschlecht": "sex", "Tumor": "tumor_type"}, inplace=True)
meta["sex"] = [{"W": 'f', "M":'m'}[x] for x in meta["sex"]]


def load_counts(filename):
    p = Path(filename)
    ((patient, tissue), ) = re.findall("(P\d+)_(.*)\.csv", p.name)
    expr = pd.read_csv(p, skiprows=5, index_col=0)
    gene_expr = expr.loc[(~expr.index.str.contains("\(Ab\)") & ~expr.index.str.startswith("Lex_")), :]
    ab_expr = expr.loc[expr.index.str.contains("\(Ab\)"), :]
    obs = pd.DataFrame().assign(cell_id=expr.columns)
    obs["patient"] = patient
    obs["tissue"] = tissue
    obs.set_index("cell_id", inplace=True)
    adata = sc.AnnData(X=scipy.sparse.csc_matrix(gene_expr).T, obs=obs)
    adata.var_names = gene_expr.index
    adata.obsm["surface_protein"] = ab_expr.T
    return adata


with Pool(16) as p:
    adatas = p.map(load_counts, filenames)

adata = anndata.concat(adatas, index_unique="_", join="outer")

meta["patient"] = [x.strip() for x in meta["patient"]]

adata.obs = adata.obs.reset_index().merge(meta, on=["patient"], how="left").set_index("cell_id")

adata

adata.obs.drop_duplicates()

adata.obs["condition"] = "NSCLC"
adata.obs["origin"] = ["tumor_primary"if c == "Tumor"else"normal_adjacent"for c in adata.obs["tissue"]]
adata.obs["sample"] = [f"{patient}_{origin}"for patient, origin in zip(adata.obs["patient"], adata.obs["origin"])]
adata.obs["sex"] = [{"m": 


    
"male", "f": "female"}[s] for s in adata.obs["sex"]]
adata.obs["tissue"] = "lung"

adata.obs.drop_duplicates()

# !mkdir -p "../../data/11_own_datasets/batch1_3patients/h5ad_raw"

adata.write_h5ad("../../data/11_own_datasets/batch1_3patients/h5ad_raw/batch1_3patients.h5ad", compression="lzf")

还有注释的marker表格：

文章分析大纲

通过整合19项研究、21个数据集共计298名患者的505份样本（图1A），「首次构建了非小细胞肺癌核心图谱」。这一综合性单细胞图谱汇集了经专家审定、质量保证且经过预分析的转录组数据，数据来源包括公开研究及我们自有数据集（UKIM-V），涵盖所有组织学类型的早期与晚期非小细胞肺癌。

非小细胞肺癌核心图谱

该核心图谱共整合898,422个单细胞，基于既往建立的经典单细胞标志（图S1A）将其注释为12个粗粒度细胞类型及44个主要细胞亚型/状态（如分裂期细胞），包括169,223个上皮细胞、670,409个免疫细胞及58,790个基质与内皮细胞（图1B）。通过已报道的标志基因22（图S1J），我们进一步标注了关键CD8+ T细胞亚群（终末耗竭型、活化型、效应记忆型、初始型、NK样、分裂期）。

细胞间通讯分析

LUAD与LUSC中癌细胞向主要免疫细胞进行通讯的Circos图。展示前10个差异表达的癌细胞配体。红色连线表示在LUAD中上调的相互作用，蓝色连线表示在LUSC中上调的相互作用。

各患者亚型中的癌-免疫细胞通讯。上图：各亚型（B、M、T、ID）中癌细胞的差异表达配体（基于伪批量数据的DESeq2分析，FDR < 0.1）。下图：相应受体及其按细胞类型的表达情况。点的大小和颜色分别表示表达受体的细胞比例和基因表达水平（所有患者的平均值）。仅显示在相应细胞类型中至少10%的细胞表达的受体数据点。

组织驻留中性粒细胞特征

A-B：扩展图谱中组织驻留中性粒细胞（TRNs）的UMAP可视化：（A）按肿瘤相关中性粒细胞（TANs）与癌旁组织中性粒细胞（NANs）分类；（B）按组织病理学类型着色（依据组织病理学评估定义）。

C：流式细胞术检测LUAD与LUSC肿瘤组织中中性粒细胞比例（占白细胞百分比）（LUAD n=47，LUSC n=16；Wilcoxon检验，**p<0.01）。水平线代表中位数，须线表示四分位距。

D：TAN候选基因筛选。每个数据点代表同时在NAN和TAN组中至少检出10个中性粒细胞的患者。连线表示各研究的均值。p值通过配对t检验计算并经FDR校正。

E：原发肿瘤样本中不同细胞类型VEGFA表达水平。每个数据点代表至少检出10个细胞的患者（中位数展示，箱线图表示四分位距，须线范围为1.5倍IQR）。

F：基于DoRothEA的TAN与NAN转录因子分析。每个数据点代表单个患者，条形表示所有患者均值。展示平均评分差异>0.2且FDR<0.1的转录因子，p值经配对t检验与FDR校正。

G：流式细胞术验证选定候选基因在肿瘤与癌旁样本中的差异。每个数据点代表未纳入scRNA-seq数据集的病例。配对Wilcoxon检验，p<0.05，***p<0.0001。CD16图示：水平线代表中位数，须线表示四分位距。

H：LUSC患者肿瘤组织与匹配癌旁肺组织中LOX-1（红色）与全细胞角蛋白（绿色）的多重免疫荧光染色。比例尺：100微米。

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