【NEW-G】scDeepVariant：深度学习+群体遗传先验，重新定义单细胞变异检测

单细胞RNA测序不仅揭示细胞异质性，更潜藏着个体遗传变异的重要信息。然而，由于覆盖稀疏、等位基因失衡等技术难题，传统变异检测方法在scRNA-seq中表现乏力，使得单细胞RNA-seq数据中蕴藏的遗传变异信息长期未被充分利用。近期，来自美国贝勒医学院的刘占东教授团队，一项名为scDeepVariant的研究提出了一种融合深度学习与群体遗传学的创新框架，该研究巧妙地将DeepVariant的图像化堆叠编码与群体遗传先验（gnomAD/1KGP）相结合，构建了一个七通道CNN模型，专门用于从稀疏、噪声高的单细胞数据中检测germline variants。实验证明，scDeepVariant不仅在常见变异检测中与LD-based方法媲美，更在罕见变异（AF<0.01）检测方面实现突破，为不同物种的单细胞多组学研究提供了可扩展的变异分析新方案。

2025 - scDeepVariant: A population-informed deep learning framework for germline variant calling in scRNA-seq - BioRxiv

一、研究框架

本研究基于单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据在检测germline variant时所面临的挑战（如低覆盖度、等位基因失衡、RNA特异性假象等），提出一种基于深度学习与群体信息整合的变异检测框架。该框架以DeepVariant为基础架构，针对scRNA-seq数据进行适配优化，并引入群体等位基因频率（Allele Frequency, AF）作为额外输入通道，构建七通道堆叠图像（包括碱基身份、质量、比对质量、链信息、变异支持、参考错配、AF通道）输入至Inception-v3卷积神经网络进行训练与推断。通过染色体分区策略划分训练、验证与测试集，确保模型评估无信息泄露，并系统比较了不同AF来源（gnomAD、1000 Genomes Project）对性能的影响。

二、主要内容

本文提出scDeepVariant（scDV），一种面向scRNA-seq数据的germline variant caller，重点解决了以下问题：

• 适应scRNA-seq特点：利用-use_spliced_alignments参数处理剪接比对，支持intron-spanning reads。

• 整合群体AF信息：通过构建局部单倍型匹配算法，将gnomAD或1KGP中的AF信息编码为图像通道，增强模型对低频率变异的判别能力。

• 系统评估性能：在ROSMAP队列（22个配对单核RNA-seq与WGS样本）上训练模型，并在独立外部数据集（7个配对scRNA-seq/WES样本）上进行基准测试。

• 与现有方法比较：包括Monopogen（基于LD的方法）、GATK HaplotypeCaller、Streika2等，评估指标涵盖精度、召回率、F1分数及在不同覆盖度与等位基因频率下的表现。

三、重要发现

1. 群体AF信息显著提升性能：

   • AF增强模型在所有测试区域（全染色体、基因体、外显子组、编码区）的F1分数提升超过0.10。

   • 在杂合变异检测中提升尤为显著（F1提升 >0.15），有效缓解了scRNA-seq中常见的等位基因丢失（allele dropout）问题。

   • 假阳性率在低频变异（AF < 0.01）中降低3–6倍，在纯合变异中降低高达51倍。

2. 在独立数据集中表现优异：

   • scDV-AF在3×覆盖度下F1达0.836–0.840，与当前最佳方法Monopogen（F1=0.878）差距仅0.04。

   • 在覆盖度≥10×时，scDV-AF性能全面超越Monopogen，F1达0.90以上。

3. 覆盖度依赖性改善：

   • scDV-AF在更高覆盖度下召回率显著提升（从3×的0.79升至20×的0.90），精度保持稳定。

   • 表明模型能有效利用更多读段证据，尤其对杂合变异检测有利。

4. 在罕见变异检测中具明显优势：

   • 在AF < 10⁻⁵的极罕见变异中，scDV-AF仍保持F1≈0.27，而Monopogen性能崩溃（F1≈0.02）。

   • 反映其不依赖LD单倍型推断，直接结合读段证据与群体先验的优势。

四、所使用的方法

1. 数据来源与预处理

• 训练数据：22个ROSMAP样本（配对snRNA-seq与WGS），比对至GRCh38，覆盖度≥3×的区域用于训练。

• 测试数据：独立7个样本（来自食管鳞癌与肺鳞癌研究），包括scRNA-seq与WES配对数据。

• 基因组坐标统一：使用CrossMap进行GRCh37至GRCh38的lift-over，保证所有工具评估一致性。

2. 模型构建

• 基于DeepVariant训练流程，启用-use_spliced_alignments与-use_allele_frequency模式。

• 六通道模型：基础架构，包括碱基身份、质量、比对质量、链、变异支持、参考错配。

• 七通道模型：额外加入AF通道，AF来源包括：1KGP、gnomAD v3（全集合）、gnomAD v3（仅PASS变异）。

• 训练策略：染色体1–19用于训练，21–22用于验证，20用于测试。

3. AF整合算法

• 对每个候选变异构建局部单倍型，与群体参考面板进行匹配。

• 通过公式计算加权AF，并经对数变换后编码为图像像素强度，增强低频变异的分辨率。

4. 性能评估

• 评估指标：精度、召回率、F1分数、准确率，基于基因型完全匹配（位置与合子型一致）。

• 覆盖度分层分析：从3×至50×逐步提高最小覆盖度阈值，观察性能变化。

• 罕见变异分析：按gnomAD AF阈值（0.1至10⁻⁶）分层评估。

5. 工具对比

• 对比方法：Monopogen、GATK HaplotypeCaller、Streika2。

• 统一使用相同真值集（WES/WGS衍生变异）与GRCh38坐标进行评估。

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Figure 1：scDV 训练与评估流程概述

图1A：数据整合与模型微调流程

• 数据来源：使用ROSMAP队列中22例配对单核RNA测序与全基因组测序样本，结合群体等位基因频率数据（来源包括gnomAD与1000 Genomes Project）。

• 染色体分区策略：

  • 训练集：染色体1–19

  • 验证集：染色体21–22

  • 测试集：染色体20（完全独立，避免信息泄露）

• 模型构建：基于DeepVariant框架，从比对读取生成七通道堆叠图像，输入Inception-v3卷积神经网络进行训练，支持从预训练RNA-seq检查点或从头初始化两种策略。

图1B：模型在测试集上的性能表现

• 比较AF整合模型（红色）与标准六通道模型（蓝色）在染色体20不同基因组区域（全染色体、基因区、外显子组、编码区）的F1分数。

• 关键结果：

  • AF整合模型在所有区域均显著优于六通道模型，F1提升超过0.10。

  • 在染色体20上，AF模型F1达0.72，六通道模型仅为0.60。

  • 表明群体AF信息可显著增强模型在不同功能区域中的变异检测稳健性。

图1C：假阳性与群体等位基因频率的分布关系

• 使用核密度估计展示假阳性调用在群体AF上的分布。

• 核心发现：

  • 六通道模型在低频变异（AF < 0.01）中假阳性显著增多。

  • AF整合模型在AF < 0.1的变异中假阳性降低3倍以上，在AF < 0.01的罕见变异中降低6倍以上。

  • 说明AF信息能有效抑制由低覆盖与等位基因失衡引起的系统性假阳性。

Figure 2：八种变异检测方法在独立数据集上的性能比较

数据集与评估设置

• 使用7个独立配对scRNA-seq/WES样本作为测试集。

• 所有评估限于覆盖度≥3×的位点。

• 比较方法包括：

  • Monopogen（基于LD的单细胞方法，紫色）

  • scDV-AF模型（三种AF来源：gnomAD、gnomAD+过滤、1KGP，红色系）

  • 六通道scDV模型（有无预训练初始化，蓝色系）

  • 传统callers：GATK HaplotypeCaller与Strelka2（灰色系）

性能指标对比

• 精度（图2A）：scDV-AF模型（~0.93）接近Monopogen（0.948），显著高于六通道模型与传统caller。

• 召回率（图2B）：scDV-AF（~0.80）略低于Monopogen（0.817），但显著优于其他方法。

• F1分数（图2C）：scDV-AF（0.836–0.840）与Monopogen（0.878）差距仅0.04，明显优于传统方法（0.506–0.646）。

• 准确率（图2D）：趋势与F1一致，scDV-AF模型表现稳健。

关键结论

• AF整合显著提升综合性能，尤其在精度与杂合变异检测方面。

• Monopogen在3×覆盖下仍具优势，但scDV-AF仅使用AF数据库（非完整单倍型面板）即达到相近性能，更具计算与数据适用性优势。

Figure 3：不同覆盖度阈值下各方法的性能变化

评估设置

• 逐步提高最小覆盖度阈值（3×, 5×, 7×, 10×, 20×, 30×, 50×），分析各方法在更高读段支持下的表现。

• 灰色虚线展示每个阈值下可评估的变异总数。

性能趋势分析

• F1分数（图3A）：

  • scDV-AF模型随覆盖度提升显著增长，从3×的0.84升至20×的0.917，在≥10×时超越所有方法。

  • Monopogen性能随覆盖度增长不明显，说明其依赖LD先验而非读段证据。

• 精度（图3B）：

  • scDV-AF精度始终稳定在0.90以上，覆盖度提升未引起波动。

• 召回率（图3C）：

  • scDV-AF召回率随覆盖度大幅提升（3×: 0.79 → 20×: 0.90），反映其能有效利用更多读段证据。

• 准确率（图3D）：

  • 与F1趋势一致，scDV-AF在覆盖度提升后逐渐领先。

关键发现

• scDV-AF能有效利用高覆盖度信息，尤其提升对杂合变异的召回能力。

• Monopogen在高覆盖下无显著提升，说明其基于LD的填补策略在读段证据充足时增益有限。

• 传统caller虽召回率随覆盖提升，但精度持续偏低，制约其整体表现。