非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高致死性动物传染病，给养猪业造成巨大经济损失。早期感染阶段病毒载量极低，亟需超灵敏的检测方法对病毒p30抗原进行精准识别。现有的数字化ELISA方法虽能实现灵敏检测，但其性能受限于微腔利用率低（导致泊松噪声限制灵敏度）以及图像识别精度不足等问题。近日，中山大学生物医学工程学院周建华教授团队在Biosensors and Bioelectronics 期刊上发表研究论文，开发了一种开放表面数字化ELISA（OS-dELISA）平台。该平台通过磁捕获构建开放空间的磁珠阵列，替代传统封闭微腔，解决了微腔利用率低的问题；结合往复流微流控加速分子传质，并通过酪胺信号放大（TSA）实现原位信号增强；同时引入改进的Mask R-CNN深度学习模型，解决了粘连磁珠识别不准的难题。实验结果表明，OS-dELISA可在17分钟内完成p30抗原检测，检测限低至21 fg/mL，血清样本验证灵敏度达100%、特异性达95%。
图1. OS-dELISA平台工作原理示意图。
该平台包括四个核心步骤：（i）在微流控通道内通过磁捕获形成高密度单层磁珠阵列，每个磁珠作为一个开放表面的检测单元；（ii）在阵列上进行夹心免疫反应捕获p30抗原，引入往复流技术加速分子结合，并通过TSA策略实现原位荧光信号放大；（iii）同时采集磁珠阵列的明场和荧光图像；（iv）利用改进的Mask R-CNN深度学习模型自动识别、分割并计数阳性磁珠，输出检测结果。
图2. 磁珠阵列的制备与稳定性表征。
研究团队在微流控芯片底部涂覆了一层聚二甲基硅氧烷（PDMS）。当抗体修饰的磁珠（直径2.8 μm）被外加磁场捕获至通道底部时，磁力使磁珠压入PDMS涂层形成凹陷（图2A-B）。基于赫兹接触模型的理论分析表明，凹陷产生的静摩擦力（2.86×10⁻⁶ N）远大于流体对磁珠的拖拽力（3.08×10⁻⁹ N），因此阵列能够稳定抵抗流体冲刷。扫描电镜图像证实了磁珠在PDMS表面的凹陷形貌（图2C-E）。实验结果进一步表明，即使在25次往复流冲洗后，磁珠保留率仍高达86.4%（图2F-G），而未涂覆PDMS或未加磁场的对照组磁珠几乎完全脱落，为后续数字化检测奠定了可靠基础。
图3. TSA信号放大策略的验证。
TSA机制利用辣根过氧化物酶催化酪胺产生高活性自由基，使荧光分子（AF488）特异性沉积在免疫复合物周围，将信号严格限制在阳性磁珠表面（图3A）。与传统夹心ELISA相比，TSA策略将检测灵敏度提高约5倍（LOD从0.115 μg/mL降至0.024 μg/mL）。将TSA与磁珠阵列结合后，荧光点数量随p30浓度升高而同步增加（图3D-E），且与人工计数的结果高度相关（Pearson r = 0.9792，图3F），证实了TSA在OS-dELISA平台中的稳定性和高灵敏性。
图4. Mask R-CNN辅助图像识别提升计数准确性。
针对传统图像处理软件（如ImageJ）在处理粘连、聚集磁珠时易误判的问题，研究引入了基于Detectron2框架的Mask R-CNN模型，以ResNet-101-FPN为骨干网络（图4A）。该模型能够精准提取磁珠边缘特征，有效分割聚集的荧光点并抑制背景噪声（图4B-C）。在63张测试图像的比对中，Mask R-CNN计数结果与人工计数几乎完美吻合（R² = 0.9979，图4D），显著优于ImageJ的拟合结果（R² = 0.9452），实现了高通量图像的高精度自动化分析。
图5. OS-dELISA平台的分析性能评估。
使用梯度浓度的p30标准品对平台性能进行系统评估（图5A）。随着抗原浓度从0增加至2.5 pg/mL，荧光图像中阳性磁珠数量呈现浓度依赖性增加（图5B）。以平均每磁珠酶分子数（AEB）对p30浓度绘制校准曲线，在30-2500 fg/mL范围内表现出良好的线性关系（R² = 0.9726，图5C-D），检测限低至21 fg/mL。与已报道的p30检测方法相比，OS-dELISA在灵敏度和检测速度上均具有显著优势，比传统试纸条方法灵敏度提高约6个数量级（图5E）。在猪血清样本（20份阴性、10份阳性）验证中，以约登指数最大值对应的AEB阈值（0.06409）为判据，平台实现了95%（19/20）的阴性符合率和100%（10/10）的阳性符合率（图5F-G），总准确率96.7%。受试者工作特征曲线下面积（AUC）达0.995（图5H），接近理论最大值1.0，表明OS-dELISA在血清样本检测中具有高度灵敏性和特异性。
总结
本研究成功构建了OS-dELISA平台，通过磁捕获在微流控通道内构建高密度磁珠阵列，以开放空间检测模式替代传统封闭微腔，结合TSA策略实现原位信号放大，有效克服了微腔利用率低的局限，将检测限降低至21 fg/mL。引入往复流技术显著加速分子传质，使整个检测流程缩短至17分钟内完成。同时，基于Mask R-CNN的深度学习框架实现了磁珠的高精度自动识别与计数，解决了传统方法在磁珠聚集情况下的误判问题。总体而言，OS-dELISA在灵敏度、检测速度和定量准确性方面展现出显著优势，为ASF的超早期诊断及其他重大动物疫病的快速筛查提供了有力工具。但当前磁珠阵列的生成方法存在空间分布不均的问题，可能影响大规模分析中的计数均匀性和可重复性，未来工作将聚焦于开发更可控、更均匀的磁珠阵列制备技术，并拓展该平台在口蹄疫等其他重大动物疫病检测及多重检测中的应用。
中山大学生物医学工程学院是论文第一单位，查勇红和廖淑菲为论文共同第一作者，周建华教授为通讯作者。该研究得到了深圳市科技计划、中国博士后科学基金、国家自然科学基金和国家重点研发计划等项目的支持。
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
Open-surface digital ELISA enabled by magnetic trapping and deep learning for rapid and highly sensitive detection of African swine fever
Yonghong Zha, Shufei Liao, Yazhi Li, Yibo Wang, Haonan Li, Jiaqi Wang, Yiren Liu, Jianpei Dong, Mingxia Sun, Jianhua Zhou
Biosens. Bioelectron., 2026, 300, 118473, DOI: 10.1016/j.bios.2026.118473
合作导师介绍
周建华：中山大学生物医学工程学院教授
https://www.x-mol.com/university/faculty/62331
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