一、：合成生物学导论与入门
主题：从DNA组装到生命系统设计
一、合成生物学定义与发展简史（1小时）
定义与核心概念
合成生物学是通过工程化方法设计和构建生物系统，以解决实际问题的跨学科领域，融合生物学、工程学和信息学。
核心目标：改写生命遗传指令，实现定制化功能（如生产药物、能源）。
发展简史
起源：20世纪中叶，DNA双螺旋结构发现和蛋白质合成技术奠定基础。
里程碑：
2000年：基因网络开关设计（Collins团队）。
2002年：人工合成脊髓灰质炎病毒（Wimmer团队）。
2010年：首个人工合成基因组细胞（Venter团队）。
2014年：非天然碱基配对整合（Romesburg团队）。
现状：21世纪后快速发展，聚焦基因组设计、细胞工程和产业应用。
二、常用软件工具与网站介绍
基因设计工具
DNAWorks：免费在线软件，用于设计寡核苷酸链（适用小片段合成）。
商业软件：如Snapgene，GenBank（序列数据库）、EMBL（欧洲生物信息学资源），支持基因组全序列下载和分析。
功能：序列优化、引物设计、模拟基因表达。
代谢通路建模工具
KEGG（京都基因与基因组百科全书）：可视化代谢通路，辅助设计合成生物学模块。
实践平台
iGEM（国际基因工程机器大赛）官网：提供标准化生物元件库和社区资源。
NCBI（美国国家生物技术信息中心）：综合数据库，支持基因序列检索和功能注释。
三、代谢数据库与知识库
核心数据库
代谢组学数据库：如HMDB（人类代谢组数据库），整合代谢物结构和功能信息。
基因组数据库：GenBank、EMBL、DDBJ（日本DNA数据库），存储全基因组序列。
功能：通过序列比对和通路映射，预测基因功能和代谢网络。
知识库应用
设计阶段：利用数据库筛选标准化生物元件（如启动子、终止子），确保设计可行性。
测试阶段：比对实验数据与数据库，验证代谢通路效率（如酶活性分析）。
四、互动实践：常用软件使用
实践目标
掌握
DNA序列设计、组装模拟。
步骤与工具
DNA设计：使用Snapgene输入目标序列，生成寡核苷酸链并模拟组装。
数据分析：通过NCBI BLAST比对序列相似性，评估设计准确性。
二、基因编辑与工具技术
eCRISPR技术、基因合成、生物元件设计（启动子/终止子）
一、基因编辑技术基础概念
基因编辑定义与核心原理
定义：通过人工干预修改生物体基因组，实现特定性状改变。
核心原理：
DNA断裂与修复：双链断裂（DSB）触发细胞修复机制（NHEJ或HDR）。
碱基编辑：直接修改单个碱基，无需断裂DNA。
基因编辑工具发展历程
第一代：ZFN（锌指核酸酶，2000年代初，靶向性差）。
第二代：TALEN（转录激活因子样效应核酸酶，2010年代，灵活性提升）。
第三代：CRISPR-Cas9（2012年诺贝尔奖，高效、低成本、可编程）。
二、CRISPR-Cas9系统详解
CRISPR系统组成与工作机制
核心组件：
Cas9蛋白：切割DNA的“剪刀”。
sgRNA（单导RNA）：引导Cas9到目标位点（含20nt互补序列）。
PAM（原间隔序列）：Cas9识别的短序列（如NGG）。
工作机制：
sgRNA与Cas9结合，形成复合物。
复合物识别PAM，切割DNA双链。
细胞通过NHEJ或HDR修复断裂。
CRISPR系统操作流程
步骤：
设计sgRNA：选择目标基因的PAM序列，设计20nt互补RNA。
构建载体：将sgRNA和Cas9基因插入质粒（如pCRISPR1）。
转化宿主：将载体导入细胞（如HEK293T细胞）。
筛选与验证：通过PCR、测序确认编辑效率。
CRISPR技术优化方向
提高特异性：使用高保真
Cas9变体（如HF-Cas9）。
降低脱靶率：优化sgRNA浓度，避免非特异性切割。
扩展应用场景：开发CRISPR-Cas12（靶向单链DNA）和CRISPR-Cas13（靶向RNA）。
CRISPR实验注意事项
实验设计：设置阴性对照（如非靶向sgRNA）。
数据分析：使用NGS（下一代测序）评估编辑效率。
三、基因编辑实验设计实践
实验方案设计要点
明确目标：编辑单个基因（如敲除）或多基因（如代谢通路优化）。
选择宿主：根据基因功能选择模式生物（如大肠杆菌、酵母、人类细胞）。
优化条件：调整sgRNA浓度、Cas9表达量、转化方法（如电穿孔）。
不同微生物宿主SgRNA设计原则
原核生物（如大肠杆菌）：
优先选择PAM序列（如NGG），避免CRISPR-Cas系统的天然防御机制。
真核生物：
避免设计在基因组重复区域或调控序列中的sgRNA。
筛选方法与验证
筛选：通过抗生素抗性或荧光标记（如GFP）筛选成功转化细胞。
验证：PCR扩增：设计引物跨越编辑位点，检测片段大小。
测序：对PCR产物进行Sanger测序，比对参考序列。
功能检测：如编辑后基因表达量（
qPCR）、表型变化（如细胞生长速度）。
单基因编辑设计与多基因编辑设计
单基因编辑：
步骤：设计sgRNA→构建载体→转化细胞→筛选→验证。
多基因编辑：
示例：在酵母中同时编辑3个代谢基因（如ADH1、PGK1、GAPDH）。
三、基因线路工程与动态调控
主题：细胞内的“逻辑电路
基因电路设计原理
一、基因线路概述
1. 定义与功能
o 基因线路
：生物体内基因表达的调控网络，通过逻辑门（与门、或门、非门）实现特定功能（如代谢调控、信号响应）。
o 核心功能：
§
开关控制：基因表达的“开/关”（如乳糖操纵子）。
§ 信号处理
：环境信号（如光、温度）的响应与转导。
§ 稳态维持：通过负反馈调节基因表达水平。
2.
应用领域
o 生物制造
：优化代谢通路。
o 疾病治疗：基因疗法。
o
环境监测：工程菌检测污染物。
3. 案例对比
o
原核案例：大肠杆菌乳糖操纵子（LacI蛋白抑制转录，乳糖诱导表达）。
o
真核案例：人类β-珠蛋白基因增强子（远端调控序列激活转录）。
二、基因线路设计原则
1.
模块化设计
o 原则：将复杂功能拆解为独立模块（如启动子、转录因子、报告基因）。
o 示例：设计“光控开关”线路，分离光敏蛋白与报告基因（如GFP）。
2.
稳定性与可预测性
o 正交设计：减少模块间干扰（如避免共用转录因子）。
o
鲁棒性：通过冗余设计（如双启动子）确保功能稳定。
3. 实验验证方法
o 荧光报告基因：定量表达水平（如GFP荧光强度）。
o
qPCR：检测转录效率（如mRNA量）。
三、实践操作：基因线路构建
1.
工具介绍
o CRISPR-Cas9：精准编辑基因（如敲除抑制子）。
o
质粒载体：携带基因线路元件（如pCRISPRi）。
o
电转化技术：将载体导入细胞（如大肠杆菌）。
2. 设计“光控开关”基因线路
o 步骤：
1.
设计光敏蛋白：选择光敏离子通道（如ChR2）或光敏转录因子（如PhyB）。
2. 构建载体
：将光敏蛋白基因与报告基因（如GFP）插入质粒。
3. 转化宿主：将载体导入大肠杆菌，筛选阳性克隆。
4.
验证功能：光照后检测GFP荧光（定性）或qPCR（定量）。
3. 实验
o
阴性对照：使用非光敏蛋白（如GFP空载质粒）。
o
优化条件：调整光强、曝光时间。
四、动态调控原理
1. 负反馈与正反馈
o 负反馈：转录因子抑制自身表达（如乳糖操纵子中的LacI蛋白）。
o
正反馈：转录因子激活自身表达（如噬菌体λ的CI蛋白）。
2. 时间延迟效应
o 原因：基因表达与调控的滞后（如转录、翻译过程）。
o
影响：导致系统振荡或稳态偏离。
3. 案例：大肠杆菌动态调控高产莽草酸
o
背景：莽草酸是合成抗病毒药物的原料。
o 调控机制
：
§ 负反馈：莽草酸合成酶（如AroB）抑制自身表达。
§ 优化策略：通过CRISPR敲除抑制子（如AroB的负调控蛋白），提高产量。
五、系统集成与案例分析（
复杂线路设计策略
o 振荡器：结合负反馈与时间延迟（如基因表达振荡）。
o 开关：利用逻辑门（如与门）控制多基因表达。
o
脉冲发生器：通过瞬时信号触发基因表达（如热激响应）。
1. 案例分析：合成生物学中的动态调控
四、代谢工程与生物制造
主题：微生物细胞工厂的理性设计与代谢通路设计与重构
一、细胞工厂与理性设计范式
1.
细胞工厂定义
o 利用工程化微生物（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母）作为“生物反应器”，通过重构代谢网络生产高值化学品（如1,3-丙二醇、氨基酸、生物燃料）。
2.
范式转型
o 传统模式：随机诱变+高通量筛选（低效、不可预测）。
o
理性设计：基于基因组尺度模型 + 代谢通量分析 + AI预测（精准、可复现）。
3. 发展历程
o 天然发酵（酿酒酵母产乙醇）→ 代谢工程（大肠杆菌产乳酸）→ AI驱动设计（AlphaFold辅助酶结构预测，优化限速步骤）。
4.
核心挑战
o 鲁棒性：抗渗透压、高温、产物毒性（如1,3-丙二醇抑制生长）。
o 效率：产物得率，需突破热力学极限。
o
原料多样性：利用农业废弃物（如秸秆水解液）替代葡萄糖，降低碳源成本。
二、物质流-能量流-信息流协同设计
1.
热力学驱动：ATP/NADH平衡
o 产物合成需消耗还原力（如NADPH用于脂肪酸合成）或产生还原力（如1,3-丙二醇生成消耗NADH）。
o
策略：引入NADH再生系统（如甲酸脱氢酶）或切换碳源（甘油 vs 葡萄糖）调控辅因子比例。
2. 动力学驱动：酶活性调控
o
限速酶（如AroE、DhaT）表达量不足导致通量瓶颈。
o 优化方法：使用NCS文库（N端编码序列）精细调控翻译效率，提升酶活性3–8倍。
3.
代谢网络重构：通量平衡分析（FBA）
o 原理
：基于质量守恒与反应约束，求解最大生物量或产物产量的代谢流分布。
4. 案例：碳-氮比调控谷氨酸棒杆菌产谷氨酸
o 高碳氮比（>20:1）激活谷氨酸脱氢酶，抑制TCA循环，使α-酮戊二酸积累并转化为谷氨酸。
三、底盘细胞开发策略
1. 设计原则
o
鲁棒性底盘：引入热休克蛋白（如GroEL/ES）增强耐热性，提升高温发酵稳定性。
o 稳定性底盘：基因组简化（删除非必需基因如
prophage、转座子），减少代谢负担与基因组不稳定性。
2. 技术方法
o 智能抗逆元件
：构建温度响应型启动子，在37°C以上激活抗逆基因表达。
o 无诱导表达系统：利用组成型强启动子替代IPTG诱导，降低生产成本。
3.
案例：枯草芽孢杆菌底盘改造
o 目标产物：N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）
o 改造策略：
§ 引入唾液酸合成途径（neuA, neuB, neuC）
§ 构建NCS文库优化关键酶表达（GFP荧光强度提升8.47倍）
§ 删除竞争途径（如glcA）减少副产物
五、 合成生物学中高通量筛选技术
1、
主题：传统高通量筛选技术
一、传统高通量筛选技术体系
1.
三大技术支柱
o 机器人自动化系统：通过协作机器人（如Explorer G3）实现96/384孔板的自动加样、温孵与转移，日处理通量可达10⁵
–10⁶样品。
o 液体处理器：精准控制纳升
–微升级液体分配（误差<2%），支持混合、稀释、分液一体化，消除人为操作偏差。
o 检测系统：
§
荧光检测：报告基因（GFP、LacZ）用于基因表达水平量化；
§ 细胞增殖检测
：MTT/Resazurin法评估细胞代谢活性；
§ 离子通道筛选：膜片钳自动化平台检测神经靶点化合物活性。
2.
数据处理流程
o 原始数据：荧光强度、吸光度、成像特征
o
标准化：Z’因子评估（Z’>0.5为合格）
o 分析工具
：GraphPad Prism、Python（pandas + scikit-learn）进行剂量响应曲线拟合与Hit筛选。
3. 案例
o
报告基因筛选：构建“GFP-乳糖操纵子”大肠杆菌库，用荧光酶标仪筛选强启动子变体。
二、微流控与液滴微流控技术
1.
技术原理
o 微流控芯片：通过光刻/软光刻技术在PDMS芯片中构建微通道网络，集成样品制备、反应、分选、检测单元（尺寸<2 cm²）。
o
液滴微流控：利用油水两相流生成皮升级（pL）单分散液滴，作为独立微反应器，实现：
§ 单细胞包裹与恒化培养
§ 酶基因表达产物的高通量筛选
§ 细胞裂解与代谢物捕获
2.
通量优势
o 传统：10³–10⁴ 样品
/天
o 液滴系统：10⁵–10⁶
液滴/小时（DropAI系统实测）
3. 实验设计
o 非标记荧光分选：利用微生物自发荧光（NADH/FAD）检测生长速率，分选“高产”菌株。
o
荧光编码系统：FluoreCode技术，通过不同荧光强度组合编码液滴组分，实现百万级组合并行筛选。
三、拉曼光谱在代谢物高通量筛选中的应用
1.
原理与优势
o 拉曼散射：激光激发分子振动模式，产生特征“指纹光谱”，无需标记即可检测：
§
脂肪酸（C-H伸缩峰：2850 cm⁻¹）
§ 聚羟基脂肪酸酯（PHAs，1240 cm⁻
¹）
§ 蛋白质二级结构（Amide I, 1650 cm⁻¹）
o
无损、快速、单细胞级：单细胞光谱采集<1秒，适用于活细胞动态监测。
2. 操作流程
o 样品准备：细胞悬液滴于硅基片或微流控出口
o
光谱采集：使用532 nm或785 nm激光，积分时间1–10 s
o 数据分析：
§ 主成分分析（PCA）区分细胞表型
§ 支持向量机（SVM）分类高产/低产菌株
3.
应用
o 油脂生产菌筛选：对产油酵母（如Yarrowia lipolytica）进行拉曼成像，识别高脂含量单细胞。
o
液滴-拉曼联用：SERS增强基底嵌入微流控芯片，实现“生成-检测-分选”一体化。
4. 技术瓶颈
o 信号弱（需SERS增强）
o 数据维度高（>1000波数点/光谱），需AI降维分析
四、
AI驱动的高通量筛选闭环
1. DBTL循环升级
o Design
：AI预测酶结构（AlphaFold）→ 优化催化位点
o Build：自动化合成基因库（CRISPR-Cas9 + Golden Gate）
o
Test：液滴微流控 + 拉曼/荧光检测 → 生成百万级表型数据
o Learn
：机器学习模型（XGBoost、神经网络）训练预测模型，反向优化设计
2. 工业级平台案例
o SynGears™平台
：AI驱动的“数字基座”，整合基因设计、通路模拟与筛选数据，实现“设计即优化”。
