1.单细胞图谱构建与糖酵解异质性解析
为探究胃癌中糖酵解的细胞异质性，本研究首先整合单细胞RNA测序数据，构建了胃癌单细胞图谱。共获得269,213个细胞，聚类为14种主要细胞类型（图2A）。肿瘤组织中免疫细胞（NK细胞、T细胞、浆细胞）比例显著升高，而正常组织中基质细胞（内皮细胞、成纤维细胞）更丰富（图2B–E）。
通过四种独立算法评估糖酵解活性，发现恶性细胞在所有细胞类型中糖酵解活性最高，且肿瘤组织的糖酵解水平显著高于正常组织（图3C–H）。空间转录组进一步证实，高糖酵解活性区域主要集中于肿瘤核心区（图3I–K）。
为精细刻画糖酵解异质性，研究基于糖酵解评分将恶性细胞分为三组：高糖酵解状态（HGS）、动态过渡状态（DTGS）和低糖酵解状态（LGS）（图4A）。HGS细胞具有更高的CytoTRACE评分，提示其分化状态更成熟（图4B–F）。拟时序分析显示HGS细胞处于更成熟的发育阶段（图4G）。代谢通路富集分析表明，HGS组中糖酵解、丙酮酸代谢等通路显著上调（图4H）。
为系统识别与高糖酵解活性相关的核心基因，本研究首先通过hdWGCNA构建基因共表达网络，共识别8个主要模块，并在HGS组中筛选出400个细胞相关核心基因（图5A–F）。
随后，通过差异表达分析，在HGS与LGS组间识别出1140个上调基因（图6A），其中222个与糖酵解相关基因重叠（图6B）。相关性分析进一步识别出131个与糖酵解活性显著正相关的基因（图6C）。富集分析显示，这些基因与胃癌、结直肠癌密切相关，并参与mRNA代谢、蛋白定位等过程（图6D–E）。
为进一步精炼核心基因，研究采用五种机器学习算法（RF、LASSO、Boruta、GBM、ABESS）进行筛选（图7A–G）。最终，五种算法的结果取交集，获得9个核心糖酵解相关基因：CD44、CLDN1、CLDN3、GPRC5A、IFNGR2、OLA1、PGK1、PLEK2、TMEM147（图7H）。
3.核心基因的验证与细胞间通讯机制
在bulk RNA-seq数据中验证了9个核心基因的表达水平（图8F）。ROC曲线分析显示，GPRC5A在单细胞和bulk数据中均表现出优异的诊断效能（AUC分别为0.782和0.877）（图8A，图9B）。多种机器学习模型（kNN、LDA、LR、XGBoost等）进一步验证了这些基因的预测能力（图8B–E）。GSEA分析确认9个核心基因与糖酵解通路显著相关（图9A），且各基因之间存在一定的表达相关性（图9C）。
在细胞间通讯方面，HGS细胞与NK细胞、T细胞、巨噬细胞等存在显著的相互作用，且HGS细胞的信号输出强度显著高于LGS细胞（图10A–D, G）。MIF信号通路在HGS细胞中显著富集，提示其在糖酵解相关细胞通讯中发挥关键作用（图10E–F, H）。
4.GPRC5A的生物学功能验证
基于上述分析，GPRC5A作为诊断效能最优的核心基因，被选为后续功能验证的靶点。实验结果显示，GPRC5A在胃癌组织和细胞系中表达显著升高（图11A–F，图12A, C）。在HGC-27细胞中敲低GPRC5A后，细胞迁移和增殖能力显著下降，克隆形成能力减弱（图12B, D–G）。体内实验进一步证实，敲低GPRC5A可显著抑制肿瘤生长（图12H–J）。此外，糖酵解关键蛋白（LDHA、PGK1、GLUT1）在GPRC5A敲低后表达下调（图11G–J），提示GPRC5A可能通过调控糖酵解影响胃癌进展。
