数据收集与预处理
Bulk RNA-seq数据整合：整合GSE7307（7例BPH，13例正常）和GSE119195（5例BPH，3例正常）数据集，去除批次效应后获得12例BPH和16例对照的统一表达谱。
OS相关基因集构建：整合文献来源的807个OS基因、MSigDB的HALLMARK_REACTIVE_OXYGEN_SPECIES_PATHWAY和GOBP_RESPONSE_TO_OXIDATIVE_STRESS等五个基因集，去重后获得1,060个独特的OS相关基因。
跨物种验证数据集：提供外部验证支持，评估标志物的生物学稳健性 | 整合两个啮齿类BPH模型数据集（GSE218403和GSE217800），经同源基因映射和批次校正后获得6例BPH和6例正常样本作为外部测试。
Bulk转录组分析
差异表达基因（DEG）分析：使用Limma包鉴定出323个上调和176个下调的DEGs（\|logFC\|>1，p<0.05）
加权基因共表达网络分析（WGCNA）：软阈值β=8时构建25个模块，grey60模块与BPH相关性最强；与DEGs和OS基因取交集获得26个OS-DEGs
功能富集分析（GO/KEGG）：GO分析显示富集于肽酶活性调节、氧化应激反应、血小板α颗粒、含铁离子结合等；KEGG分析突出HIF-1信号通路和铁死亡等OS相关通路。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络： STRING数据库构建的PPI网络显示这些基因间存在高度互联。
机器学习筛选枢纽基因
LASSO回归：10折交叉验证（重复5次）选择最优lambda，识别关键基因；
随机森林（RF）： 重复10折交叉验证（5次重复）评估变量重要性，识别前15个候选基因；
SVM-RFE：5折交叉验证整合到递归消除过程，选择平均交叉验证准确率最高的特征集，识别4个关键基因；
Boruta算法：1000次迭代计算Z分数，识别11个显著变量。
交叉验证与性能评估：避免小样本量（12 vs 16）导致的信息泄露，获得可靠的预测性能估计 ，采用嵌套重复分层交叉验证框架，最终AUC反映留出测试而非样本内性能；ACOX2、CTSB、SERPINF1的AUC分别为0.880（0.753-1.000）、0.828（0.663-0.993）、0.854（0.711-0.997）。
枢纽基因确定：整合多种算法结果，四种算法交集确定三个上调枢纽基因：ACOX2、CTSB、SERPINF1。
临床转化模型构建
列线图构建：基于ACOX2、CTSB、SERPINF1构建列线图，校准曲线显示优秀校准度，ROC分析AUC=0.922；
决策曲线分析（DCA）：使用caret和ggDCA包进行DCA分析；
共识聚类分子分型识别两个亚型：C1（非免疫浸润型）和C2（免疫浸润型）；C2中ACOX2、CTSB、SERPINF1一致上调，富集免疫相关过程。
免疫微环境分析
单样本GSEA（ssGSEA）：C2型显示更高的免疫细胞浸润和免疫功能评分，支持免疫浸润型与非免疫浸润型的分类；
免疫相关差异分析：使用reshape2和ggpubr包可视化为箱线图。
药物预测与分子对接
DSigDB药物签名匹配：通过Enrichr网站上传ACOX2、CTSB、SERPINF1，从DSigDB获得165个可能的敏感药物；
分子对接：槲皮素与CTSB结合能-7.9 kcal/mol，与SERPINF1结合能-7.3 kcal/mol；环孢素与两者结合能分别为-5.6和-5.9 kcal/mol。
单细胞RNA测序分析
数据质控与预处理：从GSE172357（13例BPH，6例正常）保留124,616个高质量细胞；过滤标准：250-5000个检测基因、<10%线粒体基因、<1%血红蛋白基因；使用DoubletFinder去除双细胞；
降维聚类与细胞注释：SCTransform归一化，PCA降维（前40个PC），分辨率0.7聚类获得23个簇，注释为9种主要细胞类型：成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、管腔上皮细胞、基底细胞、T细胞、巨噬细胞、肥大细胞、神经内分泌细胞；
OS评分与稳健性评估：使用AUCell、UCell、AddModuleScore和ssGSEA四种算法，基于三个OS基因集评分；BPH中OS水平普遍升高，成纤维细胞和巨噬细胞中最高；样本水平评分方法间一致性ρ=0.25-0.83，GO:0006979一致性最高（ρ=0.51-0.83）；
枢纽基因单细胞表达验证：ACOX2、CTSB、SERPINF1在多种细胞类型中广泛表达。
Fig 4 在单细胞水平验证BPH中枢纽基因及成纤维细胞异质性
成纤维细胞异质性深度分析
伪时间轨迹分析（Monocle 2）：重建成纤维细胞从静息到激活状态的分化轨迹，揭示BPH和正常组织共享的连续分化过程；BPH成纤维细胞在整个轨迹中OS评分持续升高；
成纤维细胞差异表达分析： edgeR伪bulk DE检验（BH-FDR校正，q<0.05）鉴定1,144个上调和471个下调基因；
成纤维细胞功能富集：上调基因富集于脂质与动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路；ACOX2被确定为成纤维细胞相关基因，沿伪时间逐渐升高；
细胞通讯分析（CellChat）：ACOX2⁺成纤维细胞在BPH微环境中具有最高的推断通讯强度，处于信号网络中心；富集血管生成、ECM重塑/纤维化、免疫调节相关通路；TNFSF12-TNFRSF12A轴被优先为候选相互作用轴；
ACOX2⁺成纤维细胞GSEA：富集过氧化物酶体代谢、PPAR信号、脂肪酸氧化、胆汁酸合成等代谢通路；
成纤维细胞亚群再聚类：识别9个成纤维细胞亚群，包括ACOX2⁺成纤维细胞；BPH中ACOX2⁺成纤维细胞扩增（29% vs 10%），Fib C5簇减少；伪时间分析显示早期成纤维细胞（Fib C1、C2、C7）逐步分化为激活的ACOX2⁺成纤维细胞；
动态表达分析：鉴定BPH进展中关键的其他基因。
独立数据集验证
使用第二个独立rGBM单细胞数据集（Abdelfattah等），相同方法提取肿瘤星形胶质细胞和小胶质细胞，DotPlot分析
SAT1、ZFP36、TLR4在两个数据集的星形胶质细胞中均上调，RBMS1表达不一致；FTH1在两个数据集小胶质细胞中表达相反；排除RBMS1和FTH1，保留SAT1、ZFP36、TLR4进行后续分析。
Fig 6 ACOX2+成纤维亚群的拟时序轨迹，以及空间转录组验证
Fig 7 ACOX2 在氧化应激条件下调节前列腺间质细胞的增殖和存活，且在良性前列腺增生组织中其表达水平升高
空间转录组学分析
空间数据预处理与整合：GSE278936数据经质控、SCTransform归一化，Harmony整合；
空间OS评分：AddModuleScore和GSVA计算OS评分，SpatialFeaturePlot可视化；
spacexr反卷积（RCTD方法）：整合ST和scRNA-seq表达谱，识别细胞类型的空间分布和细胞类型特异性差异表达模式；
BayesSpace独立验证： 独立验证反卷积结果，评估空间域与细胞类型的对应关系，q=7推断空间表达域；通过列联表和加权簇纯度（0.685）评估与RCTD的一致性；
组织学注释：基于H&E图像注释腺体丰富的上皮区域、基质/平滑肌丰富区域、血管结构和局灶性炎症聚集；
空间共定位分析：ACOX2/CTSB/SERPINF1表达与增生腺体区域的OS评分空间共定位。
实验验证
细胞培养与OS模型建立
ROS检测（流式细胞术）
ACOX2表达检测（RT-qPCR/Western blot）*
EdU增殖实验
Annexin V凋亡检测（流式细胞术）
FN1蛋白检测（Western blot）
免疫组化（IHC）
