重庆医科大学AFM：机器学习引导的DNAzyme纳米笼用于光响应免疫调节和糖尿病骨再生的时空控制

背景介绍

基因调控疗法提供了一种在转录水平选择性抑制炎症介质的直接途径。RNA切割脱氧核酶（DNAzymes）是可编程的DNA催化剂，通过Watson-Crick碱基配对识别靶RNA并切割特定磷酸二酯键。其模块化结合臂、化学稳健性、可扩展的固相合成和灵活的序列工程支持成本效益高的生产和理性的靶标重新设计。这种固有的可编程性使DNAzymes能够针对广泛的RNA转录本进行设计，实现各种病理环境下定制的转录后基因调控。重要的是，作为核酸催化剂，DNAzymes易于与化学修饰和DNA基纳米结构兼容，为将转录本选择性催化与外部控制递送耦合提供了实用基础。因此，DNAzymes是用于选择性炎症基因调控的有吸引力的分子效应器，前提是能够鉴定有效的靶标特异性序列并对其细胞内可用性进行时间门控。第一个使能步骤是高效的DNAzyme序列设计。传统DNAzyme鉴定严重依赖SELEX筛选，实验密集且耗时。计算机工具如DNAzymeBuilder促进了数据库引导的候选生成，而新兴的机器学习模型已证明从序列衍生特征估计DNAzyme活性的可行性。这些进展突出了机器学习捕获仅靠经验筛选难以解析的序列-活性关系的潜力。然而，当前机器学习工作尚未充分解决RNA切割DNAzymes的转录本特异性优化，其中催化性能还受靶位点可及性、RNA-DNA相互作用能量学、结合臂配置和切割位点周围局部结构环境的影响。将这些实验和生物物理相关特征整合到预测模型中，可能因此实现更有效地优先选择有效、靶标特异性的DNAzyme候选物。第二个使能步骤是外部控制的DNAzyme递送和释放。裸DNAzymes在生理环境中迅速降解，导致稳定性有限和靶位点积累不足。其固有负电荷和亲水性进一步阻碍有效的细胞摄取。此外，组成型DNAzyme活性对于治疗应用可能不是最优的，其中同一通路可能在一个阶段需要保留而在另一个阶段需要抑制。因此，理想的递送系统不仅应保护DNAzymes并促进细胞摄取，还应保持其活性潜伏，直到外部触发定义基因沉默何时何地开始。为实现按需激活，已开发了各种刺激响应性纳米载体。其中，光触发系统因其远程和非侵入性调节而提供有吸引力的策略。然而，紫外依赖激活受限于组织穿透差和潜在光毒性。相比之下，近红外（NIR）光提供更深的组织穿透和改善的生物安全性。一种结合结构保护、细胞内化和外部触发释放的NIR响应性DNAzyme载体，因此能够将转录本选择性抑制与炎症调节的时间要求相匹配。

研究思路

针对上述挑战，重庆医科大学陈陶教授团队提出了一种机器学习引导的、光激活DNAzyme纳米笼策略，用于靶向和时间控制的炎症调节。团队固定10-23催化核心并应用ML辅助预测与实验反馈来优化TNF-α结合臂。所选DNAzyme进一步通过光可切割连接子限制在上转换纳米颗粒耦合的DNA纳米笼内，允许NIR照射控制催化剂释放。所得构建体首先在炎症性皮肤病模型中与临床使用的TNF-α抑制进行基准比较，然后应用于糖尿病骨缺损以研究DNAzyme激活时机、炎症调节和骨修复之间的关系。通过将ML引导的DNAzyme选择与外部门控催化剂释放联系起来，该工作建立了一种在分子靶标和干预时机水平上编程炎症抑制的途径。相关内容以 Machine-Learning-Guided DNAzyme Nanocages for Photoresponsive Immunomodulation and Spatiotemporal Control of Diabetic Bone Regeneration 发表在 Advanced Functional Materials！

图片解析

图1. 用于序列优化和筛选靶向TNF-α DNAzymes的主动学习框架开发：(A) 机器学习框架示意图，包括特征工程、使用"探索"和"利用"策略的模型训练以及Dz筛选平台；(B) 基于预测分数（利用）和模型不确定性（探索）的候选选择策略；(C) 模型不确定性与实验预测误差之间的相关性；(D) 置换检验显示候选与随机采样预测误差分布的比较；(E) UMAP投影显示Round 1和Round 2后候选特征空间的分布；(F,G) 比较模型在Round 2主动学习更新前后性能的ROC曲线和精确率-召回率曲线；(H) SHAP汇总图详细展示特征重要性对活性预测的影响；(I) 比较预测和实验确定TNF-α候选集活性的混淆矩阵；(J) 在独立IL-6转录靶标上的零样本预测分析；(K) 优化DNAzyme-RNA复合物的3D结构模型；(L) LPS刺激巨噬细胞中ML筛选与报道的DNAzymes的细胞内TNF-α mRNA敲低效率比较；(M) 不同结合臂长度候选的沉默性能。

图2. UCDN的合成与表征：(A) UCDN合成过程示意图；(B) 8%天然PAGE分析确认UVDN的组装；(C) Cy5/BHQ-2标记的UVDN在不同UV照射时间后的荧光恢复；(D) CLSM图像评估NDN和UVDN在巨噬细胞中的细胞摄取和UV触发的细胞内荧光恢复，有或无UV照射；(E) UCDN的TEM和元素映射图像；(F) DLS测量的UCNPs和UCDN的流体力学尺寸分布；(G) UCNP、UVDN和UCDN的XPS光谱；(H) UCNP和UCDN的FTIR光谱；(I) 808 nm照射下UCNP和UCDN的上转换发光光谱；(J) Cy3/BHQ-2标记的UVDN、UDN和UCDN的荧光光谱。

图3. 体外生物相容性、NIR触发激活和UCDN介导的巨噬细胞表型重塑：(A) 不同浓度UCDN处理后巨噬细胞的相对细胞活力；(B) 100 μg/mL UCDN和UNDN组红细胞溶血分析；(C) Cy5/BHQ-2标记UCDN和UNDN的NIR触发荧光恢复的流式细胞术分析；(D) 示意图显示NIR触发Dz去笼蔽、随后的靶mRNA切割和下游TNF-α沉默；(E-G) ELISA、免疫荧光成像、Western blot在不同处理条件下评估LPS刺激巨噬细胞中TNF-α沉默效率；(H) iNOS免疫荧光成像；(I,J) 促炎标志物CD86的流式细胞术分析；(K-M) 通过免疫荧光成像和流式细胞术评估CD206表达；(N) RT-qPCR分析IL-6、iNOS和IL-1β的mRNA水平；(O) Western blot评估IL-10和IL-6蛋白水平。

图4. 通过微针经皮递送UCDN用于体内银屑病治疗：(A) UCDN@HA MNs制造过程示意图；(B) MN阵列的形态学表征，显示明确的金字塔几何形状；(C) UCDN@HA MNs的截面SEM图像和相应的Y、Yb和Nd元素映射；(D) 空白HA和UCDN@HA MNs的机械压缩测试；(E) 荧光图像评估Cy3/BHQ-2标记UCDN在小鼠皮肤中的经皮递送和NIR触发激活；(F) MN中UCDN随时间的释放动力学；(G) IMQ诱导银屑病小鼠模型的实验时间表；(H) 不同处理组小鼠皮肤病变的代表性宏观照片；(I,J) 使用PASI评估疾病严重程度，呈现为热图(I)和时间定量评分(J)。

图5. 空间保护的UCDN@GNPs确保体内稳定性并实现时间控制的骨再生：(A) UCDN从GNP水凝胶中72小时体外累积释放曲线，插图照片展示UCDN@GNPs制剂的可注射性；(B) 三种不同DNA纳米笼制剂加载到GNPs中的示意图：内部封装UCDN、非光响应UNDN和外部展示UEDN；(C) IVIS荧光成像监测注射后9天内Cy5标记DNAzymes（UCDN@GNPs vs UEDN@GNPs）的保留和结构稳定性；(D) 代表性IVIS荧光图像评估注射后第3天Cy3/BHQ-2 FRET系统的体内NIR触发激活；(E) 治疗糖尿病颅骨缺损的体内实验设计示意图，突出治疗组和时间NIR照射时间表（早期vs延迟激活）；(F) 正常和糖尿病缺损接受指定治疗后骨再生的代表性micro-CT 3D重建图像和相应定量分析。

图6. 延迟UCDN激活通过重编程糖尿病骨免疫微环境促进组织水平愈合：(A) 治疗后4周和8周颅骨缺损组织的H&E和Masson三色染色的代表性图像，显示不同组的新骨形成和胶原沉积；(B) 示意图描述UCDN通过调节巨噬细胞极化促进糖尿病缺损骨再生的机制；(C) 治疗后第7天缺损区域的代表性免疫荧光图像，显示CD68/CD86（促炎巨噬细胞）和CD68/CD206（促修复巨噬细胞）的共定位，以及TNF-α的表达；(D) 对应C图免疫荧光结果的巨噬细胞亚群分布和TNF-α表达水平的定量分析。

结论

该工作建立了一种机器学习引导的、光激活DNAzyme纳米笼策略，用于靶向和时间控制的炎症调节。通过固定10-23催化核心并优化结合臂，工作流程鉴定了有效的TNF-α切割DNAzymes，并将催化活性与RNA可及性和RNA-DNA相互作用能量学联系起来。将优化的DNAzyme整合到上转换纳米颗粒耦合的DNA纳米笼中进一步提供了结构保护和NIR门控催化剂释放。在IMQ诱导的银屑病样模型中，微针递送实现了与临床使用的TNF-α阻断相当的强大抗炎疗效，为优化构建体建立了疾病水平基准。在糖尿病骨缺损中，定时激活揭示了DNAzyme介导沉默的开始可影响炎症消退、巨噬细胞胞吐作用和骨修复。总之，这些发现支持了一种设计原则，即工程化DNAzyme治疗剂具有转录本水平靶标选择性和外部定义的激活时机，为组织修复期间的炎症调节提供了一种受控方法。