Nat. Commun. | 面向单细胞和血浆蛋白质组的通用深度学习分类框架

蛋白质直接参与细胞绝大多数生化过程，因此蛋白质组能够比转录组更接近地反映细胞的实际功能状态。现代质谱技术已经能够检测数千种蛋白质，并逐渐进入单细胞和大规模临床样本分析阶段，但传统蛋白质组流程通常需要先通过二级质谱进行肽段鉴定，再进行蛋白定量和统计分析，这一过程耗时且容易受到批次、样本处理和缺失值的影响。对于疾病筛查、患者分层或单细胞快速注释等任务而言，研究人员更关注“样本属于哪一类”，而不一定需要在分类前完整解析所有蛋白身份。

研究人员提出 ProFormer，一种直接利用一级质谱信号进行蛋白质组分类的 Transformer 深度学习框架。ProFormer 将每个肽离子的质荷比、保留时间、离子淌度和强度等特征作为表格输入，通过可学习的 patch merger 动态压缩高维肽离子信号，再利用自注意力机制识别跨整个蛋白质组的特征关系。与把质谱信号转换成图像后输入卷积神经网络的方法相比，ProFormer 避免固定网格分箱造成的信息损失，也能够灵活纳入新增的质谱维度。

在多种实验中，ProFormer 对技术批次变化、培养条件差异和数据噪声表现出较强鲁棒性，并在单细胞蛋白质组中成功识别细胞类型、细胞周期、迁移状态和分化状态。在血浆蛋白质组中，模型能够区分重症 COVID-19 与健康、轻症 COVID-19、脓毒症及其他严重感染，并进一步利用可解释人工智能定位驱动预测的具体肽离子。总体而言，ProFormer 展示了直接从 MS1 蛋白质组特征快速完成样本分类的可能性，为单细胞注释、临床诊断和高通量蛋白质组分析提供了一条新的技术路线。

传统底物法蛋白质组学通常先将蛋白质酶解为肽段，再利用液相色谱按照保留时间分离肽离子，在质谱中测定质荷比并记录一级质谱信号强度，最后通过二级质谱碎裂获取序列信息，进而完成肽段和蛋白质鉴定。这一流程能够提供丰富的生物学信息，但反复进行 MS2 扫描和后续数据库搜索会限制分析速度。与此同时，不同实验间鉴定到的肽段集合往往并不完全一致，容易产生缺失值和批次效应，从而影响跨实验模型的泛化。 

对于很多分类任务而言，研究人员实际上可以直接利用完整肽离子的 MS1 特征。每个肽离子都具有保留时间、质荷比、强度以及可选的离子淌度信息，这些参数共同构成一个反映蛋白质组状态的高维指纹。此前已有研究尝试将这些信号按照质荷比和保留时间分箱，再转换为二维图像输入 CNN。然而，肽离子并不像自然图像中的像素那样具有稳定的局部空间关系，相邻质谱信号也可能来自完全无关的蛋白质，因此图像化处理可能引入不合理的归纳偏置。固定分箱还可能丢失精细信号，且难以自然加入离子淌度等额外维度。

Transformer 更适合处理这种没有天然局部空间关系、但存在复杂全局依赖的表格数据。基于这一思路，ProFormer 直接以肽离子表格作为输入，通过学习型压缩和自注意力建模，试图同时解决三个问题：减少十万级肽离子带来的维度负担，提高跨批次和跨实验泛化能力，并保持每个肽离子的贡献可追踪，从而实现单肽水平的模型解释。

ProFormer 首先对每个样本的肽离子信号进行标准化，将保留时间、质荷比或质量与电荷、离子淌度和 MS1 强度转换到统一尺度。由于单个样本可能包含数万到十多万个肽离子，研究人员引入可学习的 patch merger 对信号进行动态聚合。与固定网格不同，patch merger 根据肽离子特征与内部可学习权重之间的相似性，将具有共同信息特征的信号压缩为数量固定的 token。随后加入一个分类 token，并通过多个 Transformer 编码器进行处理，每个编码器由多头自注意力、前馈网络、归一化和残差连接构成。最终分类 token 被送入分类头，输出0到1之间的样本类别概率。

研究人员首先利用 HeLa 细胞 IFN-γ 处理实验评估模型泛化性能，同时比较逻辑回归、随机森林、XGBoost、多种 CNN、视觉 Transformer 和 ProFormer。随后将框架应用到7个公开单细胞蛋白质组数据集，并进一步使用 COMBAT 血浆蛋白质组评估临床分类能力。模型采用交叉验证进行调参，并在独立测试集上评价。血浆分析中还引入 SHAP，对各个肽离子及其不同质谱特征对预测结果的贡献进行解释。

图1｜ProFormer总体架构及基于MS1肽离子特征进行蛋白质组样本分类的流程。

研究人员首先构建了一个具有明显技术挑战的 IFN-γ 分类任务。6个 HeLa 细胞培养物中的3个接受 IFN-γ 处理，并通过技术重复获得142次训练测量。约6个月后，研究人员重新测量相同样本，得到71次测试数据，以此人为制造时间批次变化。每次测量可检测约13.5万至14.5万个肽离子。虽然 IFN-γ 确实引起蛋白质组变化，但相比时间批次效应，其整体影响较弱，因此这是一个具有明显领域偏移的困难分类问题。

传统机器学习方法中表现最好的逻辑回归测试 AUC 仅为64.7%。相比之下，3D-ProFormer 和4D-ProFormer分别达到83.4%和84.0%。图像化 CNN 虽然在验证集上经常接近100%准确率，但在时间独立测试集上大幅下降。例如自定义 ResNet_v2_50 的测试 AUC 仅为79.9%，与验证集相比下降约20个百分点，其他 CNN 下降幅度甚至达到22至57个百分点。ProFormer 是唯一在验证集和测试集中基本保持一致性能的深度学习架构。  

研究人员进一步改变细胞传代、培养方式、样品制备、操作者和测量条件。在这一更加独立的生物学测试集中，4D-ProFormer 的 AUC 接近97%，明显优于其他深度模型。随后进行 IFN-γ 浓度梯度实验，模型训练时仅接触对照和100 ng/mL处理，而测试时包含多个未见过的中间剂量。只有 ProFormer 的预测分数随 IFN-γ 浓度呈合理单调增加，Spearman相关达到0.72，剂量–响应拟合度达到0.77，并能够识别低至9.44 ng/mL的处理效应，即比训练剂量低约一个数量级。

图2｜ProFormer与传统机器学习和图像深度学习模型的性能比较及跨批次、跨剂量泛化能力。

ProFormer 泛化能力的重要来源是其 patch merger。传统图像方法利用固定网格压缩数据，而 patch merger 通过可学习权重，在质荷比、保留时间、离子淌度和强度构成的多维空间中动态决定哪些肽离子应被聚合到同一 token。

分析模型内部权重后发现，不同输出 token 会重点关注质谱特征空间中不同区域，而且这些区域边界并不是固定矩形。部分 token 甚至能够同时关注多个不连续区域。这说明模型并非简单进行数据平均，而是在训练过程中主动学习哪些信号组合最有利于分类。

进一步将已经训练好的 patch merger 输出交给传统机器学习模型后，随机森林测试 AUC 可达到80.3%，明显高于波形变换等传统降维策略，尽管仍低于完整 ProFormer 的84.0%。这一结果说明，patch merger 本身已经提取了高度判别性的蛋白质组表示，而 Transformer 则进一步利用这些 token 之间的全局关系完成分类。

图3｜Patch merger对肽离子信号的动态聚合机制及其在质谱特征空间中的分布。

研究人员随后将 ProFormer 扩展到7个公开单细胞蛋白质组数据集，覆盖不同细胞类型、细胞周期、细胞迁移、干细胞状态以及细胞刺激反应。

对于差异较大的细胞群，模型表现尤其突出。HEK-293T 与 K562 细胞的分类 AUC 达到1.00，A549 与 HeLa 达到0.942；细胞周期 G1S 与 G2M 的分类同样达到1.00。对于更加细微的状态差异，模型仍保持较好性能，例如迁移与静止细胞 AUC 为0.821，小鼠胚胎干细胞不同多能状态为0.808，U-2 OS 细胞 IFN-γ 处理与未处理之间为0.736。 

这些结果说明，分类难度主要取决于不同细胞状态之间的蛋白质组相似性。当两类细胞在整体蛋白质组空间中明显分离时，模型预测接近完全准确；当不同状态大量重叠时，预测概率则更接近0.5。

研究人员还发现数据质量会直接影响结果。仅使用低丰度肽离子时模型性能较差，而保留高丰度信号后准确率明显提高。对单细胞胚胎干细胞数据，仅保留最高丰度的约60%肽离子，AUC反而从80.8%提高至约86%，说明大量低丰度、缺失率较高的信号可能增加噪声。训练样本数量也具有影响，但模型在较小数据量下仍具有一定可用性：仅使用10个样本训练时，在两个测试任务中即可分别获得约85%和75%的准确率。

在添加人工高斯噪声后，ProFormer 的分类性能保持稳定，甚至在10%噪声下仍能维持原有水平，而 ResNet CNN 随噪声增加快速下降至接近随机分类。这进一步支持其对现实测量扰动的鲁棒性。

图4｜ProFormer在不同单细胞蛋白质组分类任务中的表现以及数据维度、样本数量和噪声对性能的影响。

研究人员进一步测试 ProFormer 是否能够用于更复杂的临床血浆样本。分析使用 COMBAT 队列中的490名参与者，包括重症 COVID-19、轻症 COVID-19、脓毒症、其他严重呼吸道感染以及健康个体。研究目标是将重症 COVID-19 与其他所有状态区分开来。

血浆蛋白质组存在极大的个体差异，而且高丰度蛋白会掩盖疾病相关信号，因此这一任务比细胞实验更具挑战性。使用质荷比、保留时间和强度三个特征时，测试 AUC 为70.7%；将质荷比进一步拆分为质量和电荷后，测试 AUC 提高到86.3%，F1分数达到76.7%。通过调整预测阈值，模型可实现100%敏感度，同时保持46%的特异度。   

在分别与其他疾病比较时，模型区分重症 COVID-19 与轻症 COVID-19、脓毒症和其他严重感染的 AUC 分别达到80.6%、87.5%和98.3%。这表明模型并不仅是在识别“重病”状态，而能一定程度捕获重症 COVID-19 特有的血浆蛋白质组模式。

为了理解模型如何做出判断，研究人员进一步利用 SHAP 将预测贡献追溯到单个肽离子。质量、保留时间、电荷和强度均对模型有贡献，其中质量影响最大。选择 SHAP 贡献最高的少量肽离子训练简单随机森林，也可以获得约80%至85%的分类性能；而使用全部肽离子时仅约55%。这说明 ProFormer 实际上从大量信号中筛选出了少数真正具有判别价值的肽段。

解除肽段身份遮蔽后，高贡献信号来自补体和凝血相关蛋白，包括C3、C4A、SERPINC1以及纤维蛋白原FGA、FGB和FGG。特别值得注意的是，模型识别出3条来自C3的关键肽，其中一条与另外两条变化方向相反，恰好位于C3蛋白裂解片段边界附近，提示模型可能捕捉到了补体激活产生的蛋白水解信息，而这类信息在传统蛋白整体丰度分析中容易被掩盖。

图5｜ProFormer对COMBAT血浆蛋白质组中重症COVID-19的分类性能及单肽水平可解释性分析。

ProFormer 的核心创新并不只是把 Transformer 应用于蛋白质组，而是改变了质谱数据进入人工智能模型的方式。传统流程先解释蛋白质身份，再进行定量和分类；ProFormer 则直接利用肽离子的物理测量特征进行判别，从而绕过部分耗时的数据解释步骤。理论上，这种模式更适合临床快速筛查和大规模单细胞分类，因为这些应用最重要的问题往往是“样本属于哪一种状态”，而不是立即获得完整蛋白质列表。

研究最重要的结果之一是模型的跨领域泛化。图像 CNN 在同批次验证数据中可能获得极高准确率，但一旦面临几个月后的重新测量、噪声或新的培养和制备条件，性能明显下降。ProFormer 则在这些情况下保持相对稳定。这说明直接使用表格形式的物理质谱特征，并采用动态信号聚合，可能比人为构造质谱“图像”更符合数据本身的结构。   

另一方面，ProFormer 并不意味着传统蛋白质组学鉴定流程不再必要。本文为了建立和验证这一概念，MS1 特征实际上仍然来自经过 MS2 辅助鉴定的软件处理结果，研究人员也依赖 MS2 身份信息来确认模型找到的高重要性肽段确实对应真实生物学变化。因此，目前的 ProFormer 更准确地说是“肽段身份无关的分类模型”，还不是完全摆脱数据库搜索和 MS2 的端到端原始数据分类系统。未来若能够直接从原始 MS1 信号提取稳定特征，并完全绕过 MS2，才可能真正显著提高检测通量。  

此外，单细胞蛋白质组本身仍具有较多缺失值和低丰度噪声，对相近细胞状态的分类精度也明显低于不同细胞类型之间的分类。因此，提高质谱深度、优化低丰度信号质量并增加训练样本多样性，仍然是提升模型性能的关键。

总体而言，ProFormer 展示了一种从“先鉴定、再解释”向“直接利用质谱信号完成判别”转变的蛋白质组人工智能思路。其在批次鲁棒性、单细胞分类、临床血浆分析以及单肽水平解释方面的表现表明，这类模型有望成为未来高通量蛋白质组筛查和快速临床决策的重要组成部分。

Krull, K.K., Kühn, A., Höhn, J. et al. ProFormer: generalizable classification of single-cell and plasma proteomes using deep learning. Nat Commun 17, 10493 (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41467-026-78143-2