中山大学，最新Science大子刊：GITR激动抗肿瘤关键！

GITR激动抗肿瘤，关键在ILC2来源的IL-9

ILC2在肿瘤中既被报道可促进肿瘤进展，又被报道可发挥抗肿瘤作用，其双重性背后的分子机制尚不清楚；免疫检查点分子虽多研究于T细胞，但ILC也表达此类分子并可能影响其活化与功能，而GITR在肿瘤浸润ILC2中的功能此前未被明确。因此，肿瘤微环境如何塑造ILC2功能、GITR信号能否调控ILC2抗肿瘤效应，成为需要回答的问题。

中山大学肿瘤防治中心夏小俊研究员课题组结合人类测序数据集分析、遗传消融小鼠模型和过继转移实验，发现肿瘤浸润ILC2上的GITR参与诱导ATF3和强烈的IL-9产生，其幅度超过IL-5和IL-13的有限共同诱导；ILC2来源的IL-9通过增强嗜酸性粒细胞生存、组织滞留和细胞毒性促进瘤内嗜酸性粒细胞积累，嗜酸性粒细胞消融废除GITR介导的肿瘤控制，而过继转移嗜酸性粒细胞可恢复该效应，且该IL-9–嗜酸性粒细胞通路在缺乏适应性淋巴细胞时仍能抑制肿瘤生长；人类数据中IL-9和嗜酸性粒细胞特征与黑色素瘤和肺腺癌良好预后相关。该研究定义了一条连接ILC2与嗜酸性粒细胞介导肿瘤免疫的先天通路，并支持GITR激动作为治疗策略。相关论文以“Nuclear NAD⁺ promotes innate immune memory by inhibiting KDM5A-dependent histone demethylation”为题，发表在Sci. Immunol. 上。

为评估ILC2的临床相关性及GITR在其中的作用，研究者分析TCGA八个独立队列的bulk RNA测序数据、人ILC单细胞RNA测序数据，并在B16F10黑色素瘤、LLC肺癌和MC38结肠癌小鼠模型中检测ILC2的GITR表达，随后用GITR激动抗体DTA-1处理WT、Rag1−/−和Il5Cre-DTA小鼠，结合肿瘤负荷与免疫细胞频率分析。结果显示，ILC2特征高表达在皮肤黑色素瘤、肺腺癌和肝细胞癌中与较好总生存相关（图1a），GITR在ILC2中高表达并在肿瘤浸润ILC中上调（图1b至1d），B16F10和LLC荷瘤肺ILC2的GITR表达升高（图1e）；DTA-1在WT和缺乏成熟T、B淋巴细胞的Rag1−/−小鼠中均减少肿瘤负担（图1f和1g），而Il5Cre-DTA小鼠中DTA-1介导的肿瘤抑制完全消失（图1h和1i）。这些结果表明，GITR在肿瘤ILC2上上调，GITR激动可依赖包括ILC2在内的先天免疫细胞抑制肿瘤。

图1 GITR在肿瘤浸润ILC2上上调并参与抗肿瘤免疫。

为确定GITR参与如何改变ILC2转录程序，研究者对IL-2、IL-7、IL-33刺激并加DTA-1或同型对照的ILC2进行bulk RNA测序（图2a至2c），并用qPCR、流式细胞术、ELISA和9er报告小鼠验证（图2d至2h），同时在GITR-L处理的人ILC2中检测IL-9和IL-13（图2i）。结果显示，Il9是最显著上调基因（图2b和2c），GITR参与选择性诱导Il9 mRNA并在6小时达峰，而不改变Il5或Il13转录本；蛋白水平上IL-9增加约4.8倍，远高于IL-5的1.03倍、IL-13约1.3倍、GM-CSF 2.38倍和LTα 1.80倍（图2f），IL-5+和IL-13+ ILC2频率不变（图2d和2e），9er小鼠中EYFP+ ILC2频率增加（图2g和2h），人ILC2中GITR-L也增加IL-9而不改变IL-13（图2i）。这表明GITR共刺激主要将ILC2推向IL-9优势反应。

图2 GITR共刺激主要诱导ILC2产生IL-9。

为解析GITR诱导IL-9的转录机制，研究者对DTA-1处理ILC2的RNA-seq进行通路富集（图3a和3b），检测经典TH9相关转录因子BATF、IRF4、PU.1和GATA3，并用qPCR、免疫荧光和流式细胞术分析ATF3表达及其与IL-9的相关性（图3e至3i）。结果显示，DNA结合转录因子活性等转录程序上调（图3b），而DNA复制和染色质组织相关通路下调；经典TH9相关转录因子及GATA3未变，ATF3在DTA-1处理ILC2中最强烈上调（图3c），且不伴随经典内质网应激基因诱导（图3d）；ATF3在DTA-1处理ILC2中核内积累（图3f），IL-9+ ILC2的ATF3表达高于IL-5+ ILC2（图3g），ATF3表达与Il9 mRNA水平和IL-9+细胞频率正相关（图3h和3i），而GATA3和IRF4在群体水平与IL-9产生不相关。这表明ATF3是GITR诱导IL-9的关键转录中介。

图3 ATF3在ILC2中被GITR信号选择性诱导。

为验证ATF3是否直接调控Il9，研究者进行ATF3结合基序预测（图4a和4b）、ATAC-seq（图4c）、ChIP-qPCR（图4d和4e）和siRNA介导的Atf3敲低（图4f和4g），并检测Il9、Il5和Il13表达及IL-9+ ILC2频率。结果显示，预测的ATF3结合元件位于Il9启动子和CNS-6而非CNS-25（图4a和4b），CNS-6在对照和DTA-1刺激ILC2中均呈开放染色质且GITR刺激后可及性略增（图4c），ChIP-qPCR确认ATF3优先结合Il9启动子和CNS-6且DTA-1增强该结合（图4d），而Il5-HSIIIb和Il13-CGRE无ATF3结合（图4e）；敲低Atf3降低Il9 mRNA和IL-9+ ILC2频率，而不影响Il5和Il13（图4f和4g）。这表明ATF3通过结合Il9启动子和增强子元件促进IL-9转录，为GITR主要诱导IL-9而非IL-5或IL-13提供染色质层面机制。

图4 ATF3结合Il9调控元件，并且是ILC2中GITR诱导IL-9产生所必需。

为在体内评估GITR–ILC2–IL-9轴，研究者使用IL-9缺陷的9er小鼠（图5a至5d）、抗IL-9中和抗体（图5e至5g）、重组小鼠IL-9鼻内给药（图5h至5j）及空间免疫荧光成像（图5k），检测肿瘤负担、嗜酸性粒细胞积累和IL-9+ ILC2与嗜酸性粒细胞的空间关系。结果显示，DTA-1在WT小鼠减少肿瘤负担但在9er小鼠无效（图5a和5b）；DTA-1主要增加IL-9+ ILC2而不改变IL-5+、IL-13+、Arg+或GM-CSF+ ILC2频率，并增加WT而非9er小鼠嗜酸性粒细胞积累（图5c和5d）；抗IL-9抗体废除Rag1−/−小鼠中DTA-1介导的肿瘤抑制和嗜酸性粒细胞积累（图5e至5g），而外源IL-9足以减少荷瘤Rag1−/−小鼠肿瘤负担并增加嗜酸性粒细胞（图5h至5j）；瘤内IL9-EYFP+细胞多为ILC2，EYFP+GATA3+ ILC2与EPX+嗜酸性粒细胞优先共富集于肿瘤-瘤周边界且多位于旁分泌信号范围（图5k）。这表明IL-9对GITR介导的嗜酸性粒细胞积累和肿瘤抑制必需且足够。

图5 GITR–ILC2–IL-9轴促进嗜酸性粒细胞积累和肿瘤抑制。

为阐明IL-9如何作用于嗜酸性粒细胞，研究者检测IL-9R在naive和荷瘤小鼠嗜酸性粒细胞上的表达（图6a和6b），并在不同组织中分析，用肿瘤条件培养基和重组IL-9处理嗜酸性粒细胞，并通过共培养、凋亡检测、黏附分子qPCR和ΔdblGATA1小鼠嗜酸性粒细胞过继转移（图6g和6h）评估其杀伤与滞留。结果显示，IL-9R在naive嗜酸性粒细胞中检测不到，但在荷瘤小鼠外周血和肿瘤嗜酸性粒细胞上表达（图6a和6b），肿瘤条件培养基可诱导naive嗜酸性粒细胞Il9r；IL-9增强嗜酸性粒细胞对B16F10和LLC肿瘤细胞的杀伤（图6d和6e），上调细胞毒颗粒相关基因Rnase2a、Mbp和Ear2（图6c），并上调黏附分子转录本、增加血管外嗜酸性粒细胞比例，而不直接增强迁移或改变CCR3；DTA-1处理的WT ILC2增强嗜酸性粒细胞杀伤，而9er ILC2无此作用（图6f）；ΔdblGATA1小鼠中DTA-1抗肿瘤效应完全消失，过继转移成熟骨髓来源嗜酸性粒细胞可恢复（图6g和6h）。这表明IL-9通过增强嗜酸性粒细胞存活、滞留和细胞毒性，使其成为GITR介导抗肿瘤免疫的必需下游效应细胞。

图6 IL-9赋予嗜酸性粒细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒性。

为直接验证GITR刺激ILC2的体内抗肿瘤潜力及人类相关性，研究者将DTA-1或IgG2b预处理的WT或9er ILC2过继转移至皮下B16F10或LLC肿瘤（图7a至7d），并分析TCGA中IL-9与嗜酸性粒细胞特征的相关性及生存（图7e和7f）。结果显示，B16F10模型中仅DTA-1处理的WT ILC2减少肿瘤生长并增加瘤内嗜酸性粒细胞，DTA-1处理的9er ILC2无效（图7a和7b），LLC模型呈相同模式（图7c和7d）；人TCGA数据中IL-9和嗜酸性粒细胞特征评分在SKCM中正相关、在LUAD中相关性较弱（图7e），高IL-9特征与SKCM较好总生存相关（图7f），高嗜酸性粒细胞特征在SKCM和LUAD中均与较好生存相关。这表明GITR刺激ILC2可通过IL-9促进嗜酸性粒细胞介导的抗肿瘤免疫，并在人类癌症数据中得到支持。

图7 GITR–ILC2–IL-9信号促进嗜酸性粒细胞介导的抗肿瘤免疫。

该研究建立了GITR–ILC2–IL-9–嗜酸性粒细胞轴作为肿瘤控制的关键先天免疫通路，揭示ILC2此前未被认识的功能可塑性，并为利用该轴治疗提供机制依据；GITR激动有望扩增嗜酸性粒细胞驱动的抗肿瘤免疫，尤其在IL-9响应性癌症中。 未来仍需回答肿瘤微环境如何驱动ILC2朝向抗肿瘤或促肿瘤表型，明确肿瘤CCL11增加的细胞来源及CCL11–CCR3信号的因果要求，在患者肿瘤样本中用空间转录组学或高度多重成像直接验证该通路，并确定能否选择性调控嗜酸性粒细胞中的IL-9–IL-9R信号以增强杀瘤潜力；此外，过继转移实验未使用供体特异性同种异型标志，无法区分转移ILC2与内源ILC2，也无法直接评估供体细胞在肿瘤中的植入和持续存在。