液体活检可通过分析血浆中的循环游离DNA（cfDNA）来实现癌症早期检测，特别是分析cfDNA中与癌症相关的突变、表观遗传特征等；其中，DNA甲基化模式分析在肿瘤检测中表现出色。哺乳动物细胞中，绝大多数DNA甲基化以对称（SM）的方式发生在CpG二核苷酸上，但有约10%以半甲基化（HM）方式发生。通过亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）或MeDIP-Seq，人们已在各种细胞系中分析了半甲基化区域（HMR），但很少有研究单独或与对称甲基化CpG联合探索这些HMR用于肿瘤检测和肿瘤发生。
近日，美国哥伦比亚大学张志国教授团队在Nature Communications上发表文章，报道了两种甲基化DNA免疫共沉淀和链特异性（ss）测序方法（MeDIP-Seq），分别用于基因组DNA（ssg-MeDIP-Seq方法）和血浆cfDNA（sscf-MeDIP-Seq方法）的甲基化组分析，并利用MeDIP-seq技术与机器学习算法，对肝癌患者肝脏肿瘤DNA及cfDNA中的差异半甲基化区域（DHMRs）进行了探究。结果显示，绝大多数DHMRs与同一样本中的差异甲基化区域（DMRs）并不重叠，表明DHMRs能作为独立的生物标志物。此外，结合DMRs和DHMRs的机器学习模型在肿瘤检测方面性能更优异。
文章发表在Nature Communications
MeDIP-seq是一种用于分析DNA甲基化（5-mC）的技术，但几乎所有已发表的MeDIP-Seq程序都依赖于将基因组DNA超声处理成小片段。为此，研究团队检测了在免疫沉淀前使用Tn5转座酶能否用于基因组DNA片段化，并开发了基于pA-Tn5的MeDIP-Seq方法ssg-MeDIP-Seq，以链特异性方式分析DNA甲基化模式，检测SM和HM。
研究团队利用ssg-MeDIP-Seq分析了16个组织样本的DNA甲基化，包括8个肝肿瘤样本和8个邻近非肿瘤组织样本（图1），显示该方法可有效检测DNA甲基化。此外，通过比较肝肿瘤与邻近非肿瘤组织的甲基化组，研究鉴定了11,930个高甲基化和12,974个低甲基化DMRs；经分析，这些DMRs与使用TCGA肝癌数据集鉴定的高、低甲基化DMRs显著重叠。上述结果表明，ssg-MeDIP-seq程序可用于分析基因组DNA甲基化组。
图1.ssg-MeDIP-Seq以链特异性方式分析基因组DNA的甲基化组。肝肿瘤DNA、DHMR和DMR可能是独立的生物标志物
通过ssg-MeDIP-Seq方法，研究团队对肝癌样本进行DNA HM分析（图2）。在8个肝肿瘤样本及其相应的邻近正常组织中，分别鉴定了192,106和228,575个HMRs；并鉴定出6,864个DHMRs，包括2,330个HM增加的区域和4,534个HM减少的区域，其中大部分DHMRs与DMRs不重叠，表明DHMRs可能代表独立的生物标志物。有趣的是，
与这些肝肿瘤HMRs和HM增加的DHMRs最接近（20kb范围内）的基因都富集在与细胞代谢有关的途径中。
研究团队分析了来自8个肝肿瘤样本的24,904个DMR和6,864个DHMR中双链的甲基化密度。结果显示，DHMRs是由一条链的DNA甲基化变化引起的，DMRs是由两条链的DNA甲基化的变化引起的，这表明肝肿瘤DHMRs和DMRs可能是独立的生物标志物。
图2.通过ssg-MeDIP-Seq分析肝癌样本的DNA半甲基化已知血浆cfDNA由双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）混合组成，研究团队基于ssDNA文库制备经验，开发了sscf-MeDIP-Seq方法，用于分析cfDNA甲基化组，包括dsDNA、ssDNA和受损DNA。重要的是，sscf-MeDIP-Seq可同时分析SM和HM区域。
研究团队利用sscf-MeDIP-Seq对10名肝肿瘤患者和10名健康对照组的cfDNA样本进行分析（图3），共鉴定出2,229个高甲基化和5,002个低甲基化cfDNA DMRs，其分别与经ssg-MeDIP-Seq鉴定的肝肿瘤DNA高和低甲基化DMR有明显重叠。此外，与ssg-MeDIP-seq类似，与无CGI的基因相比，有CGI的基因启动子区域的sscf-MeDIP-seq信号减少。上述结果表明，使用sscf-MeDIP-Seq方法鉴定的肝肿瘤患者血浆cfDNA DMRs能反映肝癌细胞中DNA甲基化的变化。
研究团队还分析了8个未甲基化的DNA样本和10个肝肿瘤样本的cfDNA DHMRs，发现与肝肿瘤基因组DNA DMRs和DHMRs一致，肝肿瘤样本中的绝大多数血浆cfDNA DHMRs与相同样本的cfDNA DMRs没有重叠，表明cfDNA DHMRs也可作为肿瘤检测的独立生物标志物。
图3.用于分析cfDNA甲基化的sscf-MeDIP-Seq方法利用DMRs+DHMR训练机器学习模型进行多癌种检测
为确定sscf-MeDIP-Seq程序能否用于肿瘤起源预测，研究团队分析了三组个体（肝癌、脑癌和对照组）血浆cfDNA样本甲基化组（图4），共生成271个sscf-MeDIP-Seq数据集；随机选择215个数据集和80个对照组作为训练队列，用于训练GLMnet、随机森林和深度神经网络（DNN）模型，56个数据集作为验证队列。结果显示，GLMnet模型性能最佳。
接下来，研究团队使用DMRs、DHMRs或两者结合来训练GLMnet模型，发现与单独使用DMR或DHMR的模型相比，结合使用DMR和DHMR的模型预测更准确、预测精度更高；验证队列中，其对脑癌、肝癌和对照组的AUROC分别为0.983、0.990和0.978。基于DMR+ dhmr的模型识别脑癌、肝癌和对照样本的平均概率分别为0.72、0.75和0.76。上述结果表明，sscf-MeDIP-Seq提供了一种独特的方法来分析cfDNA DMRs和DHMRs，在肿瘤检测中具有潜在应用价值。
图4 使用DMRs和DHMRs以及机器学习模型进行多癌种检测研究团队探究了cfDNA甲基化组分析能否用于区分脑肿瘤的亚型（图5），将训练队列中77个脑肿瘤样本分为IDH突变组和IDH野生型（WT）组，使用DMRs或DHMRs作为输入来训练模型。结果显示，通过上述模型可准确识别IDH突变型和IDH野生型脑肿瘤亚型，其中基于 DMR+DHMR的模型性能最佳，对IDH突变型和IDH WT的AUROC分别为0.947和0.955。这一结果表明，使用DMRs和DHMRs作为输入的模型可准确识别神经胶质瘤亚型。
图5.使用sscf-MeDIP-Seq数据集预测脑肿瘤亚型为探索cfDNA DMRs与肿瘤样本中基因表达之间的潜在关系（图6），研究团队比较了训练队列中58个肝癌样本的cfDNA甲基化组与对照组和训练队列中脑肿瘤样本的cfDNA甲基化组，鉴定出10,051个肝癌特异性cfDNA DMRs，对其20Kb内1,689个基因进行注释，在TCGA数据库分析这些基因的表达及患者生存的关系。结果显示，有150个基因的表达与肝癌患者生存率相关，其中62个基因与高甲基化cfDNA DMRs相关，88个与低甲基化cfDNA DMRs相关。
接下来，依据上述150个基因的表达，研究团队对371例TCGA肝癌患者样本进行无监督聚类分析。结果显示，371例样本可以分为两个聚类（聚类1、2），两组患者生存期有显著差异，中位生存期分别为80个月和30个月。与聚类1相比，聚类2肝癌样本中靠近低甲基化cfDNA DMRs的基因表达量较高。
研究团队将同样方法应用于156个TCGA原发性脑肿瘤样本，发现37个基因表达与患者生存率相关；依据这些基因表达也可将样本分离成两个不同的聚类，
IDH突变患者在生存率较高的聚类中富集。上述结果显示，cfDNA DMR可能与肿瘤发生相关基因表达变化有关。
图6.基于TCGA肝脏肿瘤组织中具有肝脏肿瘤特异性cfDNA DMR邻近的基因表达对肝癌样本进行分类及患者生存预测该研究揭示了DHMRs与同源样本中的DMRs之间存在显著的非重叠性，且DHMRs可作为独立生物标志物，为癌症的早期检测与分类提供了一种新视角。同时，研究团队创新性地开发了sscf-MeDIP-Seq技术，能够同步解析cfDNA中的对称甲基化及半甲基化状态；当机器学习模型综合运用DMRs与DHMRs信息时，能够有效提升多癌种检测的精确度。
Hua X, Zhou H, Wu HC, et al. Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA. Nat Commun. 2024;15(1):6113. Published 2024 . doi:10.1038/s41467-024-50471-1·END·
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