鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌是食品中的主要致病菌，少量存在也可能对食品安全构成严重威胁。另外，死亡细菌在检测过程中可能导致假阳性，并干扰风险评估。因此，开发灵敏的活菌病原体检测方法具有重要意义。
传统培养技术（SPC）是活菌检测的金标准，不过耗时较长（1-2 d），且需要昂贵的选择性培养基、生化鉴定及专业人员。分子检测技术和免疫学技术在缩短检测周期上都具有显著的优势，不过当前发展的技术往往依赖于专门的设施和训练有素的技术人员，操作繁琐（样本预处理，如核酸提取），且易出现假阳性结果。为尽量避免死亡细菌带来的假阳性，联合SPC的多种新兴技术也得到了开发，例如电化学技术、质谱技术及基于微滴阵列的浊度分析；尽管能够定量活细菌，但是灵敏度较低且操作较为繁琐。
微流控芯片，又称为“芯片实验室”，在简化人工操作上具有显著的优势。不过，这种微小的反应体系又对观察和数据分析提出了新的要求。随着人工智能的进步与发展，深度学习逐渐被应用于细菌鉴定分型。
据麦姆斯咨询介绍，中国农业大学和美国阿肯色大学的研究人员构建了一种微坑（体积：20 nL）式微流控芯片，以实现样本中的单细菌的分散。随后，在37℃条件下水浴培养5-7 h后，利用滑动显微镜收集细菌生长情况，再利用深度学习对图像进行处理，实现细菌的鉴定。另外，通过泊松分布，对目标菌进行定量（图1）。
图1 用于活菌多重检测的数字微流控平台的示意图。（a）工作流程；（b）TLENTNet的网络结构。
实验时，取待检样本16 μL负压加载入微流控芯片中以对细菌进行分散。根据公式计算，当样本中的细菌浓度为102-104 CFU/mL时，细菌会以极高的概率实现单细胞分散。然后利用可调节硅胶加热垫对PDMS芯片进行水浴培养，并借助程序化的滑动显微镜平台每15分钟扫描一次所有微孔，以捕获每个微孔内细菌生长的时间序列图像。在这里，考虑到PDMS芯片加工及水相输入时所带入的杂质，同样也记录了阴性对照（无菌）的延时图片。随后利用所提出的TLENTNet明确4种目标菌所需的培养时间（鼠伤寒沙门氏菌：3-5 h，大肠杆菌O157:H7：3-5 h，金黄色葡萄球菌：5-7 h，蜡样芽孢杆菌：2-4 h），并对其进行分类。
相对于其它不包含时间注意机制的模型，本研究发展的模型表现性能更优：①针对上述4种目标菌的准确率分别为：97.22%，97.30%，93.75%，100%和97.96%，②评价参数更佳（表1）。
为提高模型效率和性能，并平衡模型的泛化能力和过拟合，研究人员对序列长度进行了优化。优化结果显示，在各细菌培养固定时间后采集8张延时图像（约2 h）可在尽量减少检测时间的同时，实现对所有活菌种类和阴性对照的准确分类。最后，研究人员利用人工污染的苹果汁样本评价了方法的实际应用能力。从该平台获得的活菌计数结果与金标准SPC方法具有较高的一致性，且4种同浓度的目标菌定量结果无显著差异，证明了细菌分型的准确性（图2）。不过，相较于SPC，本数字化方法在时间上具有显著优势（7 h vs. 24 h）。
图2 利用4种目标菌等比混合液污染的苹果汁评价本数字化方法的定量能力。（a）本数字化方法定量结果与SPC定量结果的比较；（b）基于数字化平台的细菌分型定量结果。
总的来说，本研究成功开发了一种深度学习增强的数字微流控平台，用于无标签、快速、准确和多重检测活的食源性病原体。研究的主要创新点包括：（1）通过设计数字化微流控芯片，协调样本中细菌浓度，使之每个微坑中封装单个细菌，提高检测灵敏度；（2）提出的TLENTNet，一种细菌种类分类的智能模型，依赖于生长差异，不需要信号标签，显著降低了检测成本。不过，文章也有几个局限性值得关注，（1）此数字化方法的检测限为63 CFU/mL，检测时间约为7 h，相较于发展的分子方法优势并不是很明显；（2）尚未应用于实际样本。根据其要求，应用于实际样本时还需要对菌数总量进行预估，否则结果可能出错。
https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115837
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