4+衰老相关+机器学习+单细胞+实验，单细胞结合机器学习的巧妙思路来袭！!

‍

导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Unveiling the role of ABI3 and hub senescence-related genes in macrophage senescence for atherosclerotic plaque progression”，这篇文章发表在Inflamm Res期刊上，影响因子为4.8。

结果：

动脉粥样硬化斑块进展中衰老相关基因差异表达的研究

细胞衰老与动脉粥样硬化有关，并导致斑块不稳定的特征。为了研究动脉粥样硬化斑块进展中的SRG特征，从GEO数据库检索微阵列谱，并且从CellAge数据库获得279个SRG。用R软件（R4.1.2）对系列矩阵文件进行标准化和简化，以（P < 0.05& P < 0.05）为标准筛选DE-SRG| logFC|> 0.5）。在GSE 163154中鉴定了总共257个SRG，包括与稳定斑块相比晚期斑块中23个上调和21个下调的DE-SRG（图1A）。同样，从GSE 41575中提取了259个SRG，根据火山图分析，其中31个基因在晚期斑块中上调，30个基因下调（图1B）。因此，发现15个常见的DE-SRG在两个数据集之间交集（图1C和D），暗示这些基因参与动脉粥样硬化斑块进展。

通过机器学习算法确定集线器DE-SRG

机器学习算法已经成为生物标志物发现的强大工具，可以识别与动脉粥样硬化等复杂疾病相关的关键基因。作者接下来采用三种机器学习算法：LASSO回归（图2A和B）、SVM-RFE（图2C和D）和RF（图2E和F）来筛选可能在动脉粥样硬化斑块进展中起作用的中枢DE-SRG。在交叉后，六个基因（ABI 3、CAV 1、IRF 7、NINJ 1、Nox 4和YAP 1）被鉴定为枢纽DE-SRG（图2G）。在GSE 43292中的进一步验证证实了ABI 3、CAV 1、NINJ 1、Nox 4和YAP 1的表达在动脉粥样硬化斑块进展期间具有显著差异（P< 0.05）（图3A-F）。然后通过ROC曲线评估五种中枢DE-SRG的诊断性能，并如下确定ROC曲线下面积（AUC）：ABI 3（AUC = 0.778）、CAV 1（AUC = 0.804）、NINJ 1（AUC = 0.705）、Nox 4（AUC = 0.863）和YAP 1（AUC = 0.851）（图3G）。当所有五个基因都包括在一个诊断模型中时，AUC值增加至0.865（图3H），表明这些中枢DE-SRG具有作为动脉粥样硬化的诊断标志物的潜力。

中枢DE-SRGs预测动脉粥样硬化进展的列线图模型的建立

为了进一步验证所鉴定的枢纽DE-SRG的临床意义，通过并入五种基因构建预测性列线图模型（图4A）。每个基因被赋予一个分数，并根据所有特征基因的分数计算总分。校准曲线表明诺模图确保了预测与实际观察之间的高度一致（图4B）。此外，决策曲线和临床影响曲线分析证实了诺模图的可靠性，突出了其使患者受益的潜力（图4C和D）。总的来说，这些发现支持了所选的五个基因预测动脉粥样硬化斑块进展的高有效性。

hub DE-SRGs与免疫细胞的相关性分析

衰老细胞在动脉粥样硬化中的积累被认为是由免疫监视缺陷引起的，并且免疫刺激剂已被证明可以增加这些细胞的去除[29]。先前的研究还在AS和非AS中鉴定了不同的免疫细胞亚群[30]。因此，作者研究了中枢DE-SRG与Jia等人收集的28个浸润免疫细胞群体之间的相关性。[31]通过ssGSEA方法测量免疫细胞富集分数。相关性分析显示，ABI 3与NK细胞、单核细胞、CD 56 bright NK细胞呈正相关; CAV 1与中枢记忆性CD 4 T细胞、NK细胞、中枢记忆性CD 8 T细胞、活化树突状细胞呈负相关; NINJ 1与单核细胞、中枢记忆性CD 4 T细胞、巨噬细胞、中枢记忆性CD 8 T细胞呈正相关。此外，发现Nox 4和YAP 1与巨噬细胞和T滤泡辅助细胞具有最显著的相关性（图5A-E）。此外，作者的分析揭示了五个枢纽DE-SRG之间的显着相互关系。具体而言，ABI 3/CAV 1（r= -0.75）、ABI 3/NINJ 1（r= 0.76）、ABI 3/Nox 4（r=-0.8）、ABI 3/YAP 1（r=-0.77）、CAV 1/Nox 4（r= 0.84）、CAV 1/YAP 1（r= 0.81）和Nox 4/YAP 1（r= 0.92）（图5F）。综上所述，这些结果表明，五个枢纽DE-SRG在塑造与动脉粥样硬化进展相关的免疫微环境中起着至关重要的作用。

ABI 3在晚期动脉粥样硬化斑块中升高

与生物信息学结果一致，先前的研究已经说明了NINJ 1、Nox 4和YAP 1在动脉粥样硬化斑块发展中的作用[32，33，34]。而CAV 1，一种在小窝形成中起关键作用的膜蛋白，已被发现在动脉粥样硬化斑块的内皮中高度表达，并且CAV 1/小窝的缺乏通过抑制低密度脂蛋白跨内皮转运和血管炎症来减弱动脉粥样硬化形成。值得注意的是，在动脉粥样硬化病变的血管平滑肌细胞中，CAV 1显著下调[35]。作者接下来关注ABI 3在动脉粥样硬化进展中的作用，因为之前没有研究过。ABI 3蛋白显示出由Src同源3（SH 3）结构域、同源框同源结构域和几个富含脯氨酸和富含丝氨酸的基序组成的复杂结构[36]，表明该蛋白参与与基因调控、信号转导和蛋白质-蛋白质相互作用相关的各种生物学过程。

为了在健康和动脉粥样硬化血管壁内的细胞类型中实现ABI 3的无偏和无富集分析，从GEO数据库获取GSE 205930包含的ScRNA-seq数据[37]。在质量控制和过滤细胞后，作者应用无偏聚类方法对细胞进行分类，得到十个不同的亚群，如UMAP图中所示（图6A）。值得注意的是，作者的分析揭示了与其他组相比，HFD 1（早期动脉粥样硬化病变）和HFD 3（晚期动脉粥样硬化病变）组中巨噬细胞比例的显著增加，如条形图所清楚地证明的（图6B）。这一观察结果表明巨噬细胞在动脉粥样硬化进展中的潜在作用。此外，UMAP可视化显示了代表CD 68（巨噬细胞的公认标志物）和ABI 3的亚型之间的明显关联。这种空间重叠意味着ABI3主要在巨噬细胞中表达（图6C），支持其潜在参与巨噬细胞相关功能。与这些发现一致，在动脉粥样硬化的胸主动脉中的巨噬细胞中ABI 3 mRNA表达显著上调，此外，在HFD 3组中观察到ABI 3 mRNA表达增强（图6D），表明ABI 3与动脉粥样硬化的晚期之间的潜在联系。

为了进一步验证这些结果，作者研究了体内晚期动脉粥样硬化病变巨噬细胞中ABI 3的表达水平，如报告所述，ApoE−/−小鼠喂食高蛋氨酸饮食4或18周，以诱导早期或晚期动脉粥样硬化病变[25]。如图7A所示，使用超声生物显微镜（UBM）成像在晚期动脉粥样硬化病变中观察到主动脉根部的内膜-中层厚度（IMT）的升高和升主动脉中血流速度的增加。同时，作者观察到斑块形成显著增加，并且病变面积占总主动脉面积的百分比在晚期病变中升高，如H&E和油红O染色所证明的（图7B）。重要的是，观察到晚期组主动脉根中ABI 3与F4/80（巨噬细胞的标志物）的共定位显著增加（图7C），表明来自晚期动脉粥样硬化病变的巨噬细胞中ABI3的表达上调，这与作者的生物信息学结果一致。

ABI3在衰老巨噬细胞中上调

p53的激活和随后p21的诱导有助于以细胞周期停滞和基因表达改变为特征的衰老表型的发展[38]。在这里，作者研究ABI 3是否参与了由Hcy诱导的巨噬细胞衰老，Hcy是动脉粥样硬化的独立危险因素。作者对p53进行了免疫荧光染色，并观察到晚期动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中p53斑点数量的显著增加，如通过主动脉根部中p53与F4/80的共定位增加所证明的（图8A）。与这些发现一致，p53、p21和ABI 3的蛋白表达水平在晚期动脉粥样硬化斑块中显著上调（图8B）。为了建立Hcy诱导的巨噬细胞衰老模型，作者如先前报道的那样用Hcy处理巨噬细胞[39]，并分析衰老标志物p53和p21的表达水平。结果显示响应于Hcy处理，巨噬细胞中p53和p21表达显著上调（图8C）。同时，衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色显示在Hcy处理后β-gal阳性细胞的数量增加（图8D）。值得注意的是，ABI 3的表达在Hcy诱导的衰老巨噬细胞中显著增强（图8C）。总的来说，这些结果表明，ABI 3可能促进响应于Hcy的巨噬细胞衰老。

NF-κB通路参与ABI 3诱导的巨噬细胞衰老

为了进一步研究巨噬细胞衰老中与ABI 3相关的潜在途径和生物学过程，作者基于分子签名数据库（MSigDB）中收集的h.all.v7.4.entrez.gmt进行了基因集富集分析（GSEA）。作者的分析揭示了与ABI 3低组相比，ABI 3高组中炎症反应途径NF-κB的显著富集（图9A）。随后，应用UCell评分来进一步计算单个细胞的特征评分，并且该评分指示HFD 3组内NF-κB途径中的高水平活化（图9B），暗示其参与动脉粥样硬化进展。此外，作者在高半胱氨酸诱导的巨噬细胞衰老模型中使用小干扰RNA（siRNA）敲低ABI 3的表达，并发现ABI 3表达的下调显著改善了巨噬细胞的衰老表型，如衰老标志物p53和p21的表达水平降低以及SA-β-Gal染色减少所示（图9C和D）。此外，ABI 3表达的敲低导致磷酸化NF-κB p65水平降低（图9C）。提示ABI 3可能通过激活NF-κB通路促进巨噬细胞衰老。

总结

在富含巨噬细胞的斑块中共鉴定出15个DE-SRG，使用三种机器学习算法进一步筛选了5个枢纽DE-SRG（ABI 3、CAV 1、NINJ 1、Nox 4和YAP 1）。随后，诺模图预测模型证实了5个中心DE-SRG用于评价动脉粥样硬化斑块进展的高有效性。此外，ABI 3表达在晚期斑块的巨噬细胞和衰老的THP-1衍生的巨噬细胞中上调，这与生物信息学分析一致。ABI 3基因敲低可抑制巨噬细胞衰老，NF-κB信号通路参与了ABI 3介导的巨噬细胞衰老。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

往期推荐

纯生信选刊

非肿瘤生信

预后模型

单基因生信

单细胞系列