4+网药+铁死亡+机器学习+分子对接+实验验证，网药赛道都这么卷了，同学们还不赶紧！！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Coix Seed Oil Alleviates DSS-Induced Ulcerative Colitis via Intestinal Barrier Repair and Ferroptosis Regulation”，这篇文章发表在J Inflamm Res期刊上，影响因子为4.2。

结果：

CSO 改善 DSS 诱导的 UC 小鼠的生理指标和减弱组织病理学特征

在本研究中，成功建立了 3% DSS 诱导的 UC 小鼠模型，并应用于探索 CSO 对 UC 的保护作用（Figure 1A ）。在本实验中，在 DSS 诱导的小鼠中观察到 UC 的典型病理特征，包括食欲下降、运动无力、腹泻和便血。与对照组相比，DSS 诱导的小鼠体重减轻（ Figure 1B ），结肠长度缩短（ Figure 1C 和 D ），DAI 评分增加（ Figure 1G ）。经 CSO 和美沙拉嗪治疗后，与 DSS 组相比，这些现象得到有效恢复。实验结束时，DSS+CSO-L 和 DSS+CSO-H 组的体重远高于 DSS 组，表明 12.5 和 50 mg/kg/d 的 CSO 给药可能对小鼠没有毒性。很明显，DSS 诱导的结肠炎小鼠的结肠长度明显短于对照小鼠，其中 DSS+美沙拉嗪、DSS+CSO-L 和 DSS+CSO-H 组可显著抑制结肠缩短。

减轻 DSS 诱导小鼠的 CSO。（A）建立 UC 小鼠和药物干预的实验图;（B）小鼠体重的百分比变化;（C）结肠的代表性照片;（D）各组间结肠长度的比较;（E）结肠组织的 HE 染色（放大倍率，100×;比例尺，200 μm）;（F）结肠组织的组织病理学评分;（G）疾病活动指数的评估。n=3-6 的。数据作为 SEM ±平均值表示。###P < 0.001，vs 对照组;*P < 0.05、**P < 0.01 和 ***P < 0.001 与 DSS 组。

H&E 染色显示 DSS 诱导的小鼠结肠组织严重损伤，如粘膜溃疡、隐窝破坏和炎性细胞浸润（Figure 1E ）。CSO 和美沙拉嗪（ Figure 1F ）显著缓解了这些病理特征，其中 50mg/kg/d 剂量的 CSO 更有效。这些结果表明，CSO 治疗可以改善 DSS 诱导的 UC 小鼠的生理指标并减弱组织病理学特征。

CSO 通过改善 UC 小鼠的肠道屏障损伤来减少炎症生物标志物并减轻 DSS 诱导的肠道损伤

测定结肠组织中促炎细胞因子的含量，以评估 CSO 对 UC 小鼠炎症的缓解。UC 小鼠 NF-κB 、 TNF-α 、 IL-1β 和 IL-6 水平始终显著高于对照组（Figure 2A–D ）。值得注意的是，这些细胞因子的水平被 CSO 下调，显著低于 DSS 组。根据结果，50 mg/kg 的 CSO 给药显示出更有效的活性。

CSO 减少了 DSS 诱导的小鼠的炎症生物标志物并减轻了 DSS 诱导的肠道屏障损伤。（公元 - 丁）结肠组织中炎症因子（TNF-α、NF-κB、IL-6、IL-1β）的相对表达;（E）结肠组织中白细胞的阿尔新染色（放大倍数，100×;比例尺，200 μm）;（F-H）结肠组织中紧密连接基因（ZO-1、Occludin、Claudin 1Ab）的相对表达。n=3 的。数据作为 SEM ±平均值表示。##P < 0.01 和 ###P < 0.001，vs 对照组;*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001 vs DSS 组。

机械屏障是肠道屏障成分之一，含有紧密连接（TJ）蛋白，TJ 蛋白的改变会导致肠道屏障裂隙的产生。35 肠上皮中的铜红细胞通过分泌粘蛋白形成附着在上皮表面的粘液层，以隔离和控制肠道微生物的定植和侵袭，从而在肠道免疫中发挥关键作用。首先，采用 alcian 染色检测黄细胞数量，结果显示 DSS 组明显减少。具体来说，在美沙拉嗪和 CSO 给药后，杯状细胞的数量和形状急剧恢复到接近正常的水平（ Figure 2E ）。TJ 蛋白的低表达是触发肠道屏障损伤的关键点，肠道屏障损伤会促进炎症爆发。 36 根据 qRT-PCR 结果，与对照小鼠相比，UC 小鼠的 ZO-1、occludin 和 claudin 1Ab 水平显着降低，美沙拉嗪和 CSO 在 50 mg/kg 时显着逆转（ Figure 2F–H ）。这些结果表明，CSO 具有很好的抗炎和肠道屏障修复作用。

“CSO-UC-Ferroptosis”中的网络药理学和生物信息学分析

筛选候选靶点

从数据库中收集 10 个 CSO 化合物和 378 个相关靶基因。从 FerrDb 平台获得 478 个铁死亡相关基因（FRG）。为了识别与 UC 相关的靶标，GSE206285 从 GEO 数据库下载了基于微阵列 GPL13158 的数据集，然后用作测试集。因此，维恩图显示 20 个交叉靶点，这些靶点被认为是 CSO 通过铁死亡途径对抗 UC 的潜在靶点（ Figure 3A ）。

继续。

“CSO-UC-Ferroptosis”的交叉靶点筛选和富集分析。（A）“CSO-UC-Ferroptosis”候选靶点的筛选;（B）“CSO-UC-ferroptosis” 交叉目标的 DEGs 热图;（C）“CSO-UC-ferroptosis” 交叉靶点的 DEGs 相关图;（D-F）“CSO-UC-Ferroptosis”交叉目标中 DEGs 的 GO 和 KEGG 富集分析。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001.

“CSO-UC-Ferroptosis”交叉目标的 DEGs 筛选结果及相关性分析

从标准化后从测试集中GSE206285 提取上述差异显著的交叉基因，发现 16 个基因表达上调，22 个基因下调（ Figure 3B ）。相关性分析表明，显著不同的基因之间的关系，其中 PTGS2 与 IL-6、KDM6B 和 ALOX5 具有很强的协同作用，而 PPARA 与 ENPP2、ALOX5 和 PTPN6 具有很强的拮抗作用（ Figure 3C ）。

“CSO-UC-Ferroptosis” 交叉目标的 GO 和 KEGG 富集分析

“CSO-UC-Ferroptosis”交叉靶点的 KEGG 通路和 GO 富集分析显示，交叉靶点的生物过程（BP）集中在对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应上。分子功能（MF）侧重于化学致癌活性氧、癌症中的胆碱代谢、ErbB 信号通路、HIF-1 信号通路和 IL-17 信号通路。细胞成分（CC）富集于膜筏和小窝通路（Figure 3D–F ），排名靠前的通路可能是 CSO 通过调节铁死亡治疗 UC 的主要机制。

通过 Lasso 和 SVM 机器学习筛选 “CSO-UC-Ferroptosis” 的特征交集目标

利用 Lasso 回归算法和 SVM-RFE 算法鉴定出 7 个基因作为 UC 的候选表征括MAPK8 、 AKR1C1 、 G6PD 、 KDM5C 、 KEAP1 、 PARP1 、 ABCC1 （ Figure 4A–D ）。利用两种不同算法获得的基因交集（ Figure 4E ），获得了五个特征基因：AKR1C1、G6PD、KDM5C、PARP1 和 ABCC1。如图所示 Figure 4F ，这 5 个特征基因在测试集中表现出良好的诊断价值。在测试组数据集中，PARP1 的 AUC 值为 0.986，ABCC1 的 AUC 值为 0.985，G6PD 的 AUC 值为 0.900，表明这 3 个基因通过铁死亡途径对治疗性 UC 的 CSO 诊断表现出极好的诊断价值。

“CSO-UC-Ferroptosis”特征交叉目标的套索和 SVM 机器学习。（A） LASSO 过滤并绘制垂直线的最佳参数;（B）能量代谢相关基因的 LASSO 系数谱;（C） SVM 交叉验证准确率图;（D） SVM 交叉验证误差图;（E）交集基因图谱;（F）“CSO-UC-Ferroptosis” 特征基因的 ROC 曲线。

GSEA 分析

为进一步探究高低表达组差异基因对不同信号通路的调控，GSEA 富集结果显示，当ABCC1 低水平表达时，前 6 条通路趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、黏着斑、造血细胞调节信号通路、JAK-STAT 信号通路和利什曼病感染均呈阳性表达（ Figure 5A ）。G6PD 和 PARP1 的结果与 ABCC1 的结果相似（ Figure 5B 和 C ）。AKR1C1 在低表达时在黏着斑、细胞因子-细胞因子受体相互作用和 ECM 受体相互作用通路中积极表达，而细胞周期、DNA 复制和剪接体通路受到抑制（ Figure 5D ）。此外，肿瘤、肾细胞癌、黏着斑和 WNT 信号通路在低 KDM5C 表达时活跃表达，而夹子切除修复和核糖体通路在低表达时活跃（ Figure 5E ）。

继续。

探索与 FRG 相关的生物过程。（A-E） ABCC1、G6PD、PARP1、AKR1C1、KDM5C 的 GSEA 分析。（F）“CSO-UC-Ferroptosis” 特征基因与免疫细胞浸润之间的相关性。（G） UC 和健康人群中特征基因之间 22 个免疫细胞相关性的热图，数据作为 SEM ±平均值表示。*P < 0.05、**P < 0.01 和 ***P < 0.001 vs 对照组。

免疫浸润分析

免疫浸润分析结果显示，UC 组与健康对照组免疫细胞存在显著差异，其中浆细胞、T 细胞 CD4 记忆静息细胞、巨噬细胞 M0 和中性粒细胞免疫细胞表达差异最显著，提示上述细胞与 UC 的发病机制密切相关（Figure 5F ).进一步分析上述免疫细胞中靶 FRGs 的免疫浸润，结果表明 ABCC1 与 M0 巨噬细胞、中性粒细胞和 CD4+ T 细胞呈正相关，与静息树突状细胞和 M2 巨噬细胞呈负相关。G6PD 和 PARP1 与 ABCC1 具有相似的免疫细胞相关性（ Figure 5G ）。

“CSO-UC-Ferroptosis”特征基因验证及 PPI 网络构建

为了进一步验证验证集中机器学习筛选的特征基因是否与测试集匹配，验证集执行了验证集GSE87473 。结果发现，AKR1C1、G6PD、PARP1 和 ABCC1 4 个基因的表达在对照组和疾病组间差异显著（ Figure 6A–D ），而 KDM5C 不显著（ Figure 6E ）。将 PPI 网络和潜在作用靶点的拓扑分析结果、上述 CSO、UC 和铁死亡相交基因上传到 STRING 数据库，并绘制初步的 PPI 网络图谱，以显示 Cytoscape 3.9.1 中的交叉基因连锁。最后，按照 Degree 分选使用 cytoHubba，作者获得了 G6PD、ABCC1 作为核心靶标（ Figure 6F ）。

“CSO-UC-Ferroptosis”特征基因的验证和 PPI 网络构建。（A-E）“CSO-UC-Ferroptosis”特征基因验证箱图;（F）“CSO-UC-Ferroptosis” 靶点的 PPI 网络的核心蛋白质图谱。

分子对接

将上述核心基因 ABCC1 、 G6PD 、 PARP1 和 AKR1C1 中表达的蛋白与活性成分豆甾醇和考克醇分子对接，以进一步验证 CSO 与核心靶点的结合能力。对接结果表明，配体和受体均可自发结合，豆甾醇和考醇的结合能（kcal/mol）分别为 -6.71 和 -5.16 与 MRP1 （Figure 7A 和 B ），AKR1C1 为 -5.59 和 -5.08 （ Figure 7C 和 D ），G6PD 为 -6.66 和 -5.18 （ Figure 7E 和 F ），PARP1 为 -8.43 和 -5.62 （ Figure 7G Table 2 和 H ）（).ABCC1 靶蛋白 GLU-694 和 G6PD 靶蛋白 LYS-360 和 GLY-242 的残基与豆甾醇发生氢键相互作用;而 ABCC1 靶蛋白 LEU-768 、 GLU-763 、 LYS-764 残基、 G6PD 靶蛋白 TYR-507 、 THR-506 残基与考克醇发生氢键相互作用。这些结果表明，CSO 中的单体成分与关键基因靶蛋白具有良好的结合活性。

FRGs 与 CSO 活性成分之间的分子对接。（A-H）模拟 CSO 的潜在有效成分（豆甾醇、Coixol）与 ABCC1、AKR1C1、G6PD 和 PARP1 蛋白之间的对接。

CSO 缓解了 RSL-3 加剧的 UC

铁死亡在肠道的生理学和病理生理学中起着不可或缺的作用。因此，进一步研究 CSO 的潜在影响以及对 UC 小鼠铁死亡的影响。铁死亡的抑制剂（Fer-1）和诱导剂（RSL-3）已被用于探索 CSO 通过该途径治疗 UC 的活性。同样，DSS 在 UC 动物模型中用作建模剂。根据先前实验的结果，剂量为 50 mg/kg 的 CSO 更有效，因此在验证实验中选择了该剂量以进行更深的实验假设（Figure 8A ）。在 11 天的实验结束时，对体重变化、结肠长度和病理表型进行了相同的测量。

继续。

CSO 减轻了因铁死亡抑制剂而加剧的 UC。（A） UC 小鼠的建立和 RSL-3 、 Fer-1 、 CSO 、 RSL-3 + CSO 干预的实验图;（B）所有组小鼠体重的百分比变化;（C）结肠的代表性照片;（D）各组间结肠长度的比较;（E）结肠组织的 HE 染色（放大倍率，100×;比例尺，200 μm）;（F）结肠组织的组织病理学评分;（G）疾病活动指数的评估。n=6 的。数据作为 SEM ±平均值表示。###P < 0.001，vs 对照组;*P < 0.05 和 ***P < 0.001 vs DSS 组。

3% DSS 饮水 6 d 后，所有模型组均开始呈现体重下降趋势。与 DSS 组相比，DSS+RSL-3 组观察到更明显的体重减轻趋势，而 Fer-1 和 CSO 的给药很好地缓解了体重的急剧减轻（Figure 8B ）。结肠长度是 UC 治疗药物使用的最重要指标之一。可见，DSS 组和 DSS+RSL-3 组小鼠瘦弱，结肠明显萎缩，出现红肿伴溃疡，肠内容物几乎消失;而 DSS+Fer-1 组和 DSS+CSO 组结肠长度缩短的情况不明显，精神状态较好。此外，即使在 DSS+RSL-3+CSO 组中，腹膜内注射 RSL-3，然后通过管饲法给予 CSO，结肠长度也没有明显缩短，小鼠状况更好（ Figure 8C 和 D ）。HE 染色中，同样可以观察到各模型组小鼠的结肠损伤程度不同，尤其是 DSS 和 DSS+RSL-3 组，结肠组织的隐窝几乎完全消失，DSS+RSL-3 组损伤比 DSS 组更严重，组织间排列松散，炎性浸润严重;施用 Fer-1 和 CSO 后，对结肠组织的损伤得到显著缓解（ Figure 8E–F ）。值得注意的是，给予 RSL-3 的给药组结肠组织的恢复和疾病活动指数似乎更有效，表明 CSO 可能通过铁死亡途径对 UC 具有保护作用（ Figure 8G ）。

CSO 减轻 RSL-3 刺激的 UC 小鼠的肠道屏障损伤

为了进一步探讨铁死亡诱导剂给药后 CSO 抗 UC 的机制，作者首先采用 AB 染色观察各组小鼠结肠组织中杯状细胞的数量和分布。结果显示与 HE 染色的损伤相似，DSS 建模后小鼠结肠组织中杯细胞的损伤严重到消失的程度，而 RSL-3 给药后隐窝和铜管的相同现象明显消失，而组织间间隙较大且排列松散，这表明这组小鼠的结肠损伤可能更严重;Fer-1 或 CSO 给药后，细胞组织形态有不同程度的改善，而 DSS+RSL-3+CSO 组的组织结构似乎比 CSO 组更完整（ Figure 9A ）。此外，通过透射电子显微镜（TEM）探查结肠组织中细胞间连接，对照组细胞间连接紧密清晰;DSS 建模后各组细胞间连接均显示裂隙或损伤。与 DSS 组相比，DSS+Fer-1 和 DSS+CSO 组的细胞间连接损伤减少甚至恢复，而 DSS+RSL-3+CSO 组的紧密连接受损，但连接丝似乎增加（ Figure 9B ）。如前所述，TJ 蛋白是衡量肠道组织屏障保护完整性的重要指标。因此，作者通过免疫组化进一步检测了结肠组织中每种 TJ 蛋白的表达。结果显示，DSS 建模后 TJ 蛋白表达显著降低，尤其是 E-cadherin、ZO-1 和 Claudin，施用 Fer-1 和 CSO 后蛋白表达明显升高，在肠上皮细胞位置更加丰富，提示 CSO 治疗 UC 可能与其促进肠道屏障修复有关（ Figure 9C ）。

继续。

CSO 减轻了铁死亡抑制 UC 小鼠的肠道屏障损伤。（A）结肠组织中白细胞的阿尔新染色（放大倍数，100×;比例尺，200 μm）;（B）透射电子显微镜（TEM）观察各组结肠组织之间的细胞间连接，红色箭头表示肠上皮细胞间连接的状态，在对照组中可看作是紧密的细胞间连接，在 DSS 和 DSS+RSL-3 组中可以看到细胞间连接被破坏，在 DSS+Fer-1 中被保护免受细胞间连接破坏， DSS + CSO 和 DSS + RSL-3 + CSO 组（放大倍率，10000×;比例尺，2μm）。（C）免疫组化测定不同组结肠组织中紧密连接蛋白（E-cadherin、ZO-1 和 Claudin）的表达。

CSO 对 UC 小鼠铁死亡的调节可能与线粒体自噬有关

铁死亡作为氧化损伤诱导的细胞死亡的非调节性模式，与 ROS 积累和炎症反应密切相关，这也被认为是导致 UC 发病机制的持续性结肠损伤的重要原因。在本实验中，作者通过试剂盒测试了相关指标成分，观察到 DSS 建模后，小鼠结肠组织中总铁离子和 MDA 浓度显著增加（ Figure 10A 和 B ），SOD 含量显著降低（ Figure 10C ），与给予铁死亡诱导剂的 DSS+RSL-3 组无统计学差异，表明 OS 超额和伤害增加。施用 Fer-1 和 CSO 后，总铁离子和 MDA 浓度降至正常值，SOD 含量恢复。

CSO 对 UC 小鼠铁死亡的调节可能与线粒体自噬有关。（A-C）小鼠结肠组织的铁、MDA、SOD 含量，n=3。（D） TEM 下每组结肠组织线粒体形态的观察，红色箭头表示线粒体膜和线粒体嵴形态的变化（放大倍率，10000×;比例尺，1 μm）。（E）免疫组化测定不同组结肠组织中铁死亡相关蛋白（GPX4 、 MRP1 、 G6PD）的表达。数据作为 SEM ±平均值表示。##P < 0.01 和 ###P < 0.001，vs 对照组;*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001 vs DSS 组。

线粒体在细胞铁代谢中起着核心作用，高浓度的铁使线粒体成为诱导铁死亡的理想部位。因此，还使用 TEM 观察结肠组织细胞中线粒体形态的变化，以研究每组小鼠结肠铁死亡的严重程度。在正常组中，线粒体内外膜和嵴清晰可见;而各建模组小鼠肠道细胞中的线粒体萎缩，外膜破裂，线粒体嵴增大，在 Fer-1 和 CSO 给药后得到缓解，线粒体形态恢复（Figure 10D ）。值得注意的是，在 DSS+RSL-3+CSO 组的 TEM 图像中观察到线粒体数量增加，线粒体中自噬囊泡出现显着增加，提示 CSO 可能通过激活线粒体自噬来缓解过度的铁死亡。

然后，进一步验证网络药理学和生物信息学预测的核心靶点是否对 UC 的预防和治疗有效。免疫组化用于检测 CSO 治疗 DSS 诱导的 UC 小鼠的途径的影响。正如预测的那样，由于 UC 铁死亡的恶化，CSO 治疗显着恢复了结肠组织中 GPX4 和 MRP1 的增加以及 G6PD 含量的降低（Figure 10E ）。

CSO 给药对肠道菌群的影响

近年来，肠道菌群的菌群失调已被认为是 UC 进展的危险因素。37 为了探讨 CSO 给药后肠道菌群的变化，从对照组、DSS 模型和 CSO 组中收集结肠内容物样本进行 DNA 提取和测序。值得注意的是，CSO 组内的变化比其他组（ Figure 11A ）显著。在群落组成方面，很明显 DSS 组在门水平上与对照组和 CSO 组存在显著差异，变形菌门和弯曲杆菌门比例的增加证明了这一点，而在 CSO 给药后，与其他细菌相比，与肠道抗炎作用相关的疣微菌群的丰度显着增强。 Figure 11B ).同样，Circos 样本-物种关系图显示，对照组的物种组成以拟杆菌门和厚壁菌门为主。DSS 建模后，上述两种细菌的丰度显著降低，取而代之的是与肠炎发病机制相关的弯曲杆菌门和变形菌门丰度的增加。相比之下，在 CSO 组中，弯曲杆菌门和变形菌门的丰度显着下降，拟杆菌门和厚壁菌门收敛到对照组的水平（ Figure 11C ）。

CSO 调节 DSS 诱导的 UC 小鼠肠道菌群的结构。（A）对照组、DSS 组和 CSO 组之间 OTU 的维恩图。（B）群落条形图分析。（c） Circos 样品-物种关系图。（D）属水平群落热图分析。（E）对照组和 DSS 组、DSS 和 CSO 组之间的肠道微生物组健康分析。n=3-6 的。*P < 0.05 vs DSS 组。

常规 Alpha 多样性和 β 多样性分析表明，由于 DSS 建模，CSO 恢复了肠道微生物丰度和多样性的变化（ Figure S1 ）。然后，作者进一步进行了物种差异分析，在属水平上，DSS 建模后 Dubosiella、Enterorhabdus 和 Rikenella 显着减少，这些在 CSO 给药后均得到恢复（ Figure 11D ）。此外，肠道微生物组健康分析（GMHI）评估肠道健康状况，这是一种基于肠道微生物组样本物种水平分类学特征的痴迷健康状况方法，这通常被认为是肠道健康和生态失调的标志。作者发现 DSS 建模后 GMHI 指数显着升高，而 CSO 给药后 GMHI 指数显着降低，表明 CSO 在健康肠道微生物的调节中发挥作用，这也与之前的结果一致（ Figure 11E ）。

总结

综上所述，本研究发现 CSO 的抗 UC 作用很可能与通过抑制铁死亡恢复肠道屏障完整性和恢复微生物稳态有关，但也需要对生物信息学预测和分子对接结果进行进一步的实验验证。作者的研究不仅揭示了抑制铁死亡以保护肠道屏障治疗 UC 的可能性，还强调了 CSO 作为临床治疗方法开发到人体研究中的潜力。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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