5+单细胞+机器学习+单基因+实验，单基因研究达到这种质量，这操作爱了！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Single-cell sequencing elucidates the mechanism of NUSAP1 in glioma and its diagnostic and prognostic significance.”，这篇文章发表在Front Immunol期刊上，影响因子为5.7。

结果：

3.1. 通过 snRNA 测序鉴定参与神经胶质瘤进展的关键细胞类型

对 9 名神经胶质瘤患者的肿瘤样本进行单核 RNA 测序（snRNA-seq），以研究这些样本中的细胞多样性。经过质量控制和过滤，作者通过降维聚类分析了 22,392 个细胞，确定了对应于六种不同细胞类型的 22 个簇：少突胶质细胞（771）、神经胶质神经元细胞（13,760）、星形胶质细胞（4,980）、平滑肌细胞（106）、血管细胞（519）和骨髓细胞（2,256）（ Figure 1A，上）。在分析的 22,392 个细胞中，14,611 个表现出 IDH1 突变，而 20,931 个是 IDH1 野生型（ Figure 1A）。UMAP 图说明了这六种细胞类型在不同细胞周期阶段的分布： S 期 5,051 个细胞，G1 期 13,728 个细胞，G2M 期 3,613 个细胞（ Figure 1A，底部）。

snRNA 测序揭示了 GBM 进展过程中的主要细胞类型（A）来自 9 名患者的 22392 个聚集单细胞的 UMAP 投影显示了人神经胶质瘤中不同细胞类型的组成。UMAP 预测按簇编号、簇分配、组和细胞周期阶段显示。（B）显示 IDH1 组中 6 种细胞类型与 IDH1 野生型组的百分比的条形图。（C）描绘 GBM 组中 6 种细胞类型与 IDHR132H WT GBM 组的百分比的箱线图。（D）气泡图显示 Top10maker 基因在不同细胞类型的神经胶质瘤细胞中的差异表达。（E） UMAP 图展示了以下相关特征的分布：nCount_RNA、nFeature_RNA、G2M.score 和 S.score。（F）火山图显示 6 种细胞类型中的差异基因表达。（G） GO-BP 富集分析揭示了与 6 种细胞类型相关的生物过程。

采用条形图来描述队列中六种细胞类型的分布，该队列由 8 例 IDH1 野生型病变患者和 1 例 IDH1 突变病变患者组成（Figure 1B）。该图表突出显示了神经胶质瘤患者细胞类型的异质性。箱形图进一步强调了不同队列中这六种细胞表型之间的明显差异（ Figure 1C）。在肿瘤样本中鉴定的 6 种细胞类型中，标记基因表达各不相同，每种细胞类型的前 10 个标记显示在气泡图（ Figure 1D）中。

RNA 特征，包括 nCount_RNA、nFeature_RNA、G2M 评分和 S 评分，通过 UMAP 图可视化（Figure 1E）。词云显示了跨细胞类型的基因本体生物过程（GO-BP）富集的通路术语，而火山图突出显示了六种细胞类型中的不同基因（ Figure 1F）。热图显示了 6 种细胞表型中独特表达基因的 GO-BP 富集分析结果（ Figure 1G）。

3.2. 神经胶质神经元细胞的细胞内异质性

为了分析神经胶质神经元细胞的恶性肿瘤，作者应用了推断的 CNV 算法在单细胞水平上识别恶性细胞。根据推断的拷贝数变异（CNV），将 CNV 水平升高的细胞归类为神经胶质瘤细胞（ Supplementary Figure 1），揭示了三个亚群：C0 MALAT1+ 神经胶质瘤细胞（2,508）、C1 AKAP9+ 神经胶质瘤细胞（1,788）和 C2 NUSAP1+ 神经胶质瘤细胞（1,566）（ Figure 2A）。作者检查了这三个亚组中细胞周期阶段、亚群和谱系的分布。

胶质细胞神经元细胞亚群的可视化（A） UMAP 图显示了神经胶质瘤患者肿瘤细胞的 3 个细胞亚群以及每个亚群中的细胞数量（左上）;UMAP 图显示了 3 个细胞亚群中不同细胞周期的百分比（右上）;UMAP 图显示了 IDH1 突变组与 IDH1 野生型组在 3 个细胞亚群中的分布（左下）;和 UMAP 图显示了 3 个细胞亚群的患者来源（右下）。（B）可视化 3 个细胞亚群相关特征的 UMAP 图：CNVscore、nCount_RNA、G2M.score、S.score。（C）条形图显示了 IDH1 突变组与 IDH1 野生型组中 3 个细胞亚群的百分比（左）;箱线图描述了 IDH1 突变体组中 3 个细胞亚群与 IDH1 野生型组（右）的百分比。（D）火山图显示 3 个细胞亚群中差异基因的表达。（E）显示 3 个细胞亚群中基因通路富集的词云图。（F）气泡图显示 Top10maker 基因在 3 个细胞亚群中的差异表达。（G） GO-BP 富集分析显示与 3 个细胞亚群相关的生物过程。

UMAP 表示用于可视化三个细胞亚组的 CNV 评分、nCount_RNA、S 评分、G2M 评分和其他相关属性（Figure 2B）。此外，在 8 例 IDH1 野生型病变和 1 例 IDH1 突变病变（ Figure 2C，左）中目视检查了这三种亚型的分布。C2 NUSAP+ 神经胶质瘤亚群主要见于 SF12264 患者。箱形图显示各组中三个亚群的不同比例（ Figure 2C，右）。火山图突出显示了三个亚群中每个亚群中的差异表达基因（ Figure 2D）。词云在这些亚组中显示了丰富的基因本体生物过程（GO-BP）通路术语（ Figure 2E）。使用气泡图和热图可视化三个亚群中具有差异表达的标记基因（ Figure 2F），生成热图以说明三个亚组中不同基因集的 GO-BP 富集分析结果（ Figure 2G）。

3.3. 使用 CytoTRACE 和 monocle 对神经胶质细胞和神经元细胞亚群进行伪时间分析

为了探索神经胶质瘤细胞亚群的分化和发育轨迹，作者进行了 CytoTRACE 分析（ Figure 3A），揭示了从 C1 到 C0 再到 C2 （ Figure 3B的分化模式）。条形图说明了三个细胞亚群在 IDH1 突变体和 IDH1 野生型队列中的分布（ Figure 3C，左）。值得注意的是，C2 NUSAP1 + 胶质瘤细胞亚群是 IDH1 野生型组独有的。这一发现为探索 IDH1 突变体组和野生型组之间的关系提供了一个起点。其他条形图说明了三个细胞亚群在细胞周期不同阶段的分布（ Figure 3C，右）。nd 显示轨迹分化不同阶段细胞百分比的变化（ Figure 3D）。在状态 1 中，表达 C0 MALAT1 的神经胶质瘤细胞最普遍。在状态 2 中，表达 C1 AKAP9 的神经胶质瘤细胞占主导地位，而在状态 3 中，表达 C2 NUSAP1 的神经胶质瘤细胞最丰富。

通过 cytotrace 和单片细胞对 3 个神经胶质瘤细胞亚群进行拟议的时间序列分析的可视化（A）使用 Cytotrace 分析神经胶质瘤细胞亚群的分化。颜色可以表示区分级别。右图表示根据不同神经胶质瘤细胞亚群显示的细胞示踪结果。颜色代表不同的细胞亚群。（B）显示胶质瘤细胞亚群细胞示踪分析的可视化结果的箱线图。（C）可视化了 3 个细胞亚群在不同伪时间阶段中相关特征的占有率“：IDH1 突变组与 IDH1 野生型组（左）中 3 个细胞亚群的占有率;3 个细胞亚群在不同细胞周期中的占有率（右图）。（D）条形图说明了三个单元子组中不同伪时间阶段（state1-state3）的比例。（E）证明神经胶质瘤细胞亚群的衍生过程。左：显示 3 个细胞亚群的拟议时间轨迹的 UAMP 图;中：UMAP 图显示胶质瘤细胞亚群的伪时间轨迹，从右上角开始，分为两个分支，其中一个向下分化，另一个向左分化;右图：UMAP 图显示了拟议的时间轨迹图上 3 种状态的分布。（F）显示胶质瘤细胞亚群的 3 个细胞亚群变化的散点图;拟议的时间顺序 UMAP 图显示了与拟议时间顺序的 3 个命名基因相对应的细胞亚群的变化;以及细胞亚群（MALAT1 、 AKAP9 、 NUSAP1）的 3 个命名基因在伪时间轨迹上的表达。

为了进一步了解神经胶质瘤的发展，作者使用单克隆技术对三种细胞亚型进行了额外的轨迹分析（ Figure 3E）。这三种细胞亚型沿伪颞轨迹呈连续分布，最终在分支点发散。轨迹从右上象限开始，并推进到指定为状态 1 的分化点。此时，谱系分裂：一个分支继续向尾部移动，对应于状态 3，而另一个分支向左移动，与状态 2 对齐。按时间顺序，C1 AKAP9+ 神经胶质瘤细胞亚群似乎代表了肿瘤发生的早期阶段。随着肿瘤发生的进展，该亚群分化为其他亚型，最终成为 C0 DOCK5+ 或 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤细胞。作者确定了与三个细胞亚群相关的基因，并使用伪时间序列散点图、 UMAP 图和伪散点图绘制了它们的动态轨迹。分析显示，以 AKAP9 基因为标志的 C1 细胞亚群主要存在于时间序列的早期，而以 NUSAP1 基因为特征的 C2 亚群在伪时间序列的末尾更为普遍（ Figure 3F）。

3.4 胶质瘤细胞亚群伪颞轨迹的弹弓分析

作者使用弹弓方法进一步分析了三个胶质瘤细胞亚群（C0 至 C2）的分化轨迹。这些亚群沿时间轴一致分布，形成谱系（ Figure 4A）。频谱 1 说明了从 C1 到 C0 的进展，然后是到 C2 （ Figure 4B）的转变。为了了解这些伪时间轨迹背后的生物学机制，作者对 GO-BP 进行了富集分析。C1 亚群与聚合和微管动力学等过程相关。C2 与信号介导和免疫反应有关，而 C3 与嘧啶代谢有关，C4 与有丝分裂过程有关（ Figure 4C）。散点图说明了沿 Spectrum 1 的不同细胞亚群的分布，突出了它们在伪时间上的独特分化模式（ Figure 4D）。

胶质瘤细胞亚群伪时间轨迹的 Slingshot 分析（A） UMAP 图显示 Lineage1 随拟合时间顺序的变化;（B） UMAP 图显示了 Lineage1 在拟合时间顺序上的分化轨迹（右）。（C） GO-BP 富集分析，证明与拟议的神经胶质瘤细胞亚群时间轨迹相对应的生物过程。（D）散点图显示了弹弓可视化后获得的神经胶质瘤细胞亚群的三个细胞亚群的命名基因的轨迹。

3.4. 细胞间相互作用的 CellChat 分析和 PTN 信号通路可视化

为了更好地了解复杂的细胞反应，作者旨在探索细胞间动力学和配体-受体通讯网络。使用 CellChat 分析，作者构建了涉及各种细胞类型的细胞间通讯网络，例如神经胶质瘤亚群、少突胶质细胞、骨髓细胞、星形胶质细胞、平滑肌细胞和血管细胞。作者通过测量连接厚度来量化交互频率，并根据线宽评估交互强度 Figure 5A。为了研究各种细胞群和信号通路的协调性，作者使用 CellChat 的非负矩阵分解技术进行模式识别。作者的分析揭示了将细胞群连接为信号发射器（出站）或接收者（入站）的通信模式。使用 CellChat 的基因表达工具，作者进一步探索了这些细胞相互作用和信号通路。作者首先将假设的通信模式与分泌细胞队列联系起来，以阐明传出信号传导模式。然后，作者将这些模式与分泌细胞群相关联。作者确定了三种通讯模式，每种模式都与特定细胞类型相关：模式 1（神经胶质瘤亚群）、模式 2（血管内皮细胞）和模式 3（少突胶质细胞和髓系细胞）（ Figure 5B）。对于胶质瘤传出信号传导，模式 1 以 PTN 和 NCAM 等通路为特征。相比之下，胶质瘤传入信号传导主要涉及模式 1 通信模式，包括 VEGF、PTN 和 JAM （ Figure 5D）等通路。采用 CellChat 的模式识别方法，作者定量分析了神经胶质瘤内的配体-受体相互作用，以确定与三种细胞亚型相关的关键信号通路。在神经胶质瘤中，每个细胞变体在通信网络中都充当发送者和接收者，释放各种细胞因子或配体并响应来自其他细胞的信号（ Figure 5C）。

CellChat 结果演示（A）圆圈图显示所有细胞之间相互作用的数量（左）和强度（右）。（B）显示所有单元格中流出细胞的模式识别（左）和输入细胞的模式识别（右）的热图。（C）输出贡献气泡图和传入贡献气泡图，显示每个细胞亚群与神经胶质瘤细胞亚群中其他细胞之间的细胞通讯模式的表达。（D）桑树图显示所有细胞之间的细胞通讯模式。顶部：传入 Mulberry 图，底部：传出 Mulberry 图。（E）显示所有细胞相互作用的传入和传出信号强度的热图。（F）显示 PTN 、 NCAM 和 VEGF 信号通路网络中心性评分的热图。（G） PTN、NCAM 和 VEGF 信号通路中细胞相互作用的小提琴图。（H）胶质瘤细胞亚群与 PTN 信号通路中其他细胞相互作用的分层图。（I）热图显示的 PTN 信号通路中细胞的相互作用。

作者创建了一个热图来可视化所有细胞相互作用中传入和传出信号的强度，特别关注参与 PTN 信号转导通路（ Figure 5E）。利用中心性测量算法，作者根据细胞类型在细胞间通讯中作为介质和影响者的作用对细胞类型进行分类。以 NUSAP 表达为特征的胶质瘤 C2 亚群被确定为 PTN 信号级联反应的关键参与者。此外，作者发现参与细胞粘附的 NCAM 信号转导通路和与血管生成相关的 VEGF 通路在 C1 AKAP9+ 神经胶质瘤亚群中尤为突出（ Figure 5F）。Violin 图突出显示了细胞相互作用，显示了 C2 组中的 NUSAP+ 神经胶质瘤亚群，在 PTN 信号级联反应中活性升高。相比之下，C1 组中的 AKAP9+ 神经胶质瘤亚群显著参与 NCAM 和 VEGF 信号转导通路（ Figure 5G）。作者确定了神经胶质瘤组织中的所有八种细胞类型都是 PTN 信号级联的起源。三种神经胶质瘤亚型以及其他细胞类型被认为是潜在靶标，在分层图中突出了它们在 PTN 信号通路中的相关性。研究结果表明，除了骨髓细胞、少突胶质细胞和血管内皮细胞（VECs）外，各种细胞类型在 PTN 级联反应中充当信号介质。显示细胞间相互作用复杂网络的热图如所示 Figures 5I, H。

3.5. 预后模型的开发和验证

为了评估已鉴定细胞类型的临床意义，作者对 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤亚组中的前 100 个标记基因进行了单变量 Cox 分析。该分析揭示了与患者预后相关的三个基因 — RPA3 、 TUBA1C 和 NUDT1 Figure 6A。为了解决基因库内的多重共线性问题，作者使用套索回归来优化选择，确定了对 NUSAP+ 神经胶质瘤评分系统至关重要的三个关键基因。Lambda 图验证了该基因子集（ Figure 6B）的稳健性。根据患者对所选基因的表达水平分为两组：NUSAP+ 胶质瘤评分高组和低 NUSAP+ 胶质瘤评分组。生存分析表明，与高 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组相比，低 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组的个体获得了更好的生存结果（ Figure 6C）。对构成 NUSAP+ 神经胶质瘤评分模型的三个基因进行了生存分析（ Figure 6D）。结果一致表明，表达水平升高与较差的生存率相关，而表达水平降低与预后结局改善相关，从而肯定了它们作为危险因素的作用。通过将基因表达水平与其相应的回归系数积分来确定 TCGA-GBM 队列中每位患者的 NUSAP+ 神经胶质瘤评分。随后，根据中位数将患者分为高分组和低分组。较高的 NUSAP+ 神经胶质瘤评分与生存时间缩短相关。模型中三个基因的表达水平如所示 Figure 6E。相关性分析显示总生存期（OS）与 NUSAP+ 胶质瘤评分和 3 个基因呈负相关。这些关系以散点图的形式直观地表示 Figure 6F。ROC 曲线用于评估 NUSAP+ 胶质瘤评分对 1 年、 3 年和 5 年生存的预测准确性，AUC 值分别为 0.579、0.792 和 0.625 （ Figure 6G）。散点图显示了与 NUSAP+ 神经胶质瘤评分相关的遗传因素（ Figure 6H），并 Figure 6I突出了高低 NUSAP+ 胶质瘤评分组之间基因表达水平的差异。进行多因素 Cox 回归分析以确定 NUSAP+ 胶质瘤评分是否作为独立的预后因素。该分析包括年龄、种族、T 分期、N 分期、M 分期和 NUSAP+ 神经胶质瘤评分等变量，显示后者是神经胶质瘤患者预后的重要独立预测因子（p < 0.05）（ Figure 6K）。此外，还生成了一个柱状图，以利用年龄、种族和 T 分期将临床和病理风险因素与细胞类型特征相结合。该图表提供了对患者 1 年、 3 年和 5 年生存概率的有效预测 Figure 6J。

与 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分相关的预后建模（A）森林图显示构成 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的基因的单变量 Cox 分析。零线 HR=1，HR<1 保护因子，HR>1 危险因素。（B）构成 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的三个基因通过套索回归筛选（上图）;构成 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的基因的 Lambda 图（下图）。（C）在 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组和低亚组中筛选构成 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的 3 个基因的生存分析。（D）包含 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组和低亚组的 3 个基因的生存分析图。（E）显示 C2 NUSAP+ 胶质瘤高亚组和低亚组风险评分的曲线图（上图）;散点图显示 C2 NUSAP+ 胶质瘤高亚组和低亚组之间生存状态的变化（中图）;和热图显示 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组和低亚组中的基因表达，并带有基于归一化数据的色标（下图）。蓝色表示 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤低亚组，红色表示 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组。（F） C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分、总生存期（OS）和用于建模的基因之间的相关性分析。橙色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色阴影表示高或低相关。（G） ROC 图中显示了 1 、 3 和 5 年的 AUC 分数。AUC（1 年）：0.579，AUC（3 年）：0.792，AUC（5 年）：0.625。（H）散点图说明了构成 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的基因与 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的相关性分析。（I）峰图和箱形图说明了构成 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的三个基因在 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高分组和低分组之间的表达变化。（J）根据年龄、C2 NUSAP+ 胶质瘤高分和低分亚组以及分期预测 1 年、3 年和 5 年总生存期（OS）的组合图。（K）显示 C2 NUSAP+ 胶质瘤评分与其他临床因素的多变量 Cox 回归分析的森林图。在 null 行中，HR=1。HR<1 被认为是保护因素，而 HR>1 被视为风险因素。*p<0.05.

3.6. 高 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组和低 NUSAP+ 胶质瘤评分组之间的免疫浸润差异

为了研究神经胶质瘤中的免疫浸润并评估高低 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组之间免疫细胞群的差异，作者利用热图来可视化每组内免疫细胞浸润的变化（ Figure 7A）。接下来，作者通过使用 CIBERSORT 计算工具分析来自 TCGA 存储库的数据来评估神经胶质瘤患者的免疫细胞浸润。采用热图来显示样本中鉴定的 22 种不同免疫细胞类型的分布（ Figure 7B）。条形图用于描述免疫细胞类型和胶质瘤亚群标志物之间的关系。NUSAP+ 神经胶质瘤评分显示与 M0 巨噬细胞、静息树突状细胞和其他免疫细胞呈正相关，而它们与活化的 NK 细胞、单核细胞和其他细胞类型呈负相关（ Figure 7C）。采用各种免疫细胞含量评估方法比较和总结所研究的 3 个基因与免疫细胞之间的关联。这些关系使用热图进行说明，其中正相关用红色表示，负相关用蓝色表示（ Figure 7D）。小提琴图显示高分组和低分组的免疫功能障碍和肿瘤排斥反应，与高分组相比，低分组观察到 TIDE 评分显着升高（ Figures 7E, F ）。ADORA2A 的表达存在于两组的肿瘤中，但相对于低评分组，高 NUSAP+ 胶质瘤评分组的表达明显较低。

C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组和低亚组免疫浸润的差异分析（A）热图显示了 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组和低亚组中各种免疫评分的表达。（B）免疫浸润叠加条形图（上图）;显示神经胶质瘤中 22 种免疫细胞表达的箱线图（下图）。（C）棒棒糖图显示免疫细胞与 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分之间的相关性。（D）免疫细胞与 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分基因之间的相关性显示为带有热图的条形图。*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01;P≤ 0.001 表示差异显著，NS 表示差异不显著。（E）小提琴图显示 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤高亚组和低亚组中的高低 TIDE 值。（F）小提琴图显示不同组 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤之间 AODRA2A 的表达。*p ≤ 0.05， **p ≤ 0.01;p ≤ 0.001 表示差异显著，ns 表示差异不显著。

3.7. 差异和富集分析

为了比较高和低 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组，作者采用火山图和热图来说明每组中不同基因的表达模式（ Figures 8A, B）。为了研究 C2 NUSAP+ 胶质瘤亚组在胶质瘤发病机制中的作用，作者对区分这些组的基因进行了功能富集分析。气泡图显示了基因本体论（GO）富集分析的结果，强调这些基因主要参与寡糖结合、肽聚糖结合以及与听觉受体细胞发育相关的通路（ Figure 8D）。条形图中描述的 KEGG 富集分析揭示了与神经活性配体-受体相互作用和 cAMP 信号转导通路等通路的显著关联（ Figure 8C）。此外，基因集富集分析（GSEA）评分表明跨各种途径的基因富集，如差异表达基因的 GO-BP 富集条目所示（ Figure 8E）。

说明了不同组之间的富集分析、突变分析和药物敏感性分析。（一、二）火山和热图说明了高 C2 和低 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤组中各种基因的表达。（C）各种途径的富集结果显示在差异表达基因的 KEGG 富集分析中。（D）说明所有基因本体论（GO）富集分析（GOBP、GOCC、GOMF）结果的条形图。（E）通过对差异表达基因的 GO-BP 富集条目的 GSEA 评分来表示各种途径中基因的富集评分。（F）突变瀑布图说明了两组体细胞中前 30 个最常突变基因的方差。上列表示每个样品的突变载量，右列表示这些样品中该基因突变的总百分比。（G）模型基因的 CNV 状态。（H）小提琴图用于显示 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤的高分组和低分组之间的突变负荷差异。（I）散点图说明了突变负荷与 C2 NUSAP+ 神经胶质瘤评分的相关性分析。（J）评分以肿瘤突变负荷为基础，分为四组：高危高突变负荷组、高危低突变负荷组、低风险高突变负荷组、低风险低突变负荷组。显示了四组生存分析结果的曲线。（K）显示药物敏感性分析的箱形图。

3.8. 突变分析

作者分析并可视化了肿瘤微环境（TME）内的基因突变，以确定它们与两个细胞队列中免疫成分的相关性。该分析揭示了这些间充质细胞队列中突变频率最高的前 30 个基因的差异。垂直条显示每个样本的突变负担，而水平条表示样本中每个基因的总体突变流行率（ Figure 8F）。在分析的基因中未检测到显着的染色体拷贝数变异（CNV），如 CNV 谱中没有显着的增益或损失所示（ Figure 8G）。采用小提琴图检查高 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组和低 NUSAP+ 胶质瘤评分组之间的突变负荷变化，显示无统计学意义差异（ Figure 8H）。然而，散点图显示突变负荷和 NUSAP+ 神经胶质瘤评分之间存在统计学意义相关性（P<0.05） Figure 8I）。根据突变负荷将肿瘤分为四类：高 NUSAP+ 胶质瘤评分伴高 TMB，高 NUSAP+ 胶质瘤评分伴低 TMB，低 NUSAP+ 胶质瘤评分伴高 TMB，低 NUSAP+ 胶质瘤评分伴低 TMB。生存分析显示，NUSAP+ 胶质瘤评分低、TMB 高的组表现出最有利的生存结果，而 NUSAP+ 神经胶质瘤评分高、TMB 低的组预后最差（ Figure 8J）。

3.9. 药物敏感性分析

小提琴图用于描述高 NUSAP+ 神经胶质瘤评分组和低 NUSAP+ 胶质瘤评分组对各种药物的不同反应，强调药物敏感性的变化（Figure 8K）。相对于低评分组，高 NUSAP+ 胶质瘤评分组阿昔替尼的 IC50 值升高，表明前者的药物反应性降低。

3.10. 沉默 NUSAP 抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和转移

在作者研究 NUSAP1 对神经胶质瘤的影响时，作者通过转染进行了 NUSAP1 基因敲低，并使用 RT-qPCR 确认转染效率（ Supplementary Figure 2）。随后，对阴性对照（NC）和 si-NUSAP1 实验组的 U251 和 LN229 神经胶质瘤细胞系进行集落形成测定（ Figure 9A）。结果表明，抑制 NUSAP1 导致 U251 和 LN229 细胞中的集落大小减小，表明 NUSAP1 的下调会阻碍神经胶质瘤细胞增殖（ Figure 9B）。为了评估 NUSAP1 对神经胶质瘤细胞迁移的影响，进行了划痕和 transwell 测定，如图所示 Figure 9C。作者的研究结果表明，敲低 NUSAP1 后 U251 和 LN229 细胞的迁移潜力显著降低（ Figures 9D, E）。因此，NUSAP1 的抑制对神经胶质瘤细胞增殖和迁移均显示出抑制作用，这一点使用 CCK-8 测定法得到了进一步验证（ Figures 9F, G）。

沉默 NUSAP1 抑制增殖、迁移和转移，同时促进神经胶质瘤细胞凋亡。（A）对 NC 和 si-NUSAP1 组的 U251 和 LN229 神经胶质瘤细胞进行集落形成测定。在 si-NUSAP1 组中观察到较小的集落，表明 NUSAP1 沉默抑制神经胶质瘤细胞增殖。（B）集落形成测定结果的定量显示，与 NC 组相比，si-NUSAP1 组的集落大小减小。（C） Transwell 试验显示，与 NC 组相比，si-NUSAP1 组 U251 和 LN229 细胞的迁移能力降低。划痕试验显示，与 NC 组相比，si-NUSAP1 组 U251 和 LN229 细胞的迁移能力降低。（D）划痕测定结果的定量显示，与 NC 组相比，si-NUSAP1 组的伤口闭合百分比降低。（E） transwell 测定结果的定量显示，与 NC 组相比，si-NUSAP1 组中侵袭细胞的数量减少。（F） CCK-8 测定进一步证实了 NUSAP1 沉默对 LN229 细胞增殖的抑制作用。（G） CCK-8 测定进一步证实了 NUSAP1 沉默对 U251 细胞增殖的抑制作用。**p<0.01， ***p<0.001.