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导语：中性粒细胞在肿瘤微环境（TME）中发挥关键作用；然而，它们在胶质母细胞瘤（GBM）中的功能被忽视且研究不足。对与GBM相关的中性粒细胞（GBMAN）亚群进行详细分析可能为GBM免疫疗法提供新的见解和机会。
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本研究通过单细胞RNA测序结合机器学习揭示了与胶质母细胞瘤相关的中性粒细胞异质性，并建立了一个VEGFA+中性粒细胞预后模型。文章发表在《Biology Direct》上，文章题目为：Large-scale bulk and single-cell RNA sequencing combined with machine learning reveals glioblastoma-associated neutrophil heterogeneity and establishes a VEGFA+ neutrophil prognostic model。本研究整合了一个大型单细胞转录组数据集，包括来自127个样本、66名患者的498,747个细胞（图1A）。在进行降维和聚类后，本研究使用详细的标记信息对细胞簇进行了注释，识别出15种不同的细胞类型，包括肿瘤相关中性粒细胞（TAN）、癌症相关成纤维细胞（CAF）、周细胞、内皮细胞、增殖型CD8+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、B细胞、单核细胞、增殖样MoTAM、MoTAM、Mg_TAM、肿瘤细胞、增殖样肿瘤细胞和少突胶质细胞（图1B）。没有特定标记表达的细胞被分类为未知细胞。然后本研究分离出TANs并进行了二次降维和聚类，识别出四种GBMAN亚型：MNDA+GBMAN、LGALS1+GBMAN、ADM+GBMAN和VEGFA+GBMAN（图1C）。每种亚型的特定标记表达如图1D所示。
为了验证这些亚群的有效性，本研究评估了每个GBMAN亚型的纯度，发现所有四个亚型的ROGUE值均超过0.9（图1E），表明其具有高纯度和稳定性。相关性分析揭示，MNDA+GBMAN和LGALS1+GBMAN具有相似的特征，ADM+GBMAN和VEGFA+GBMAN也有相似的特征（图1F）。最后，对亚群比例的比较显示，在复发患者中，MNDA+GBMAN的比例显著减少，而VEGFA+GBMAN的比例显著增加（图1G）。这些发现表明，GBM中存在四种中性粒细胞亚型。
通过应用Palantir算法，本研究发现中性粒细胞从MNDA+GBMAN逐渐发展为VEGFA+GBMAN（图2A-B）。值得注意的是，本研究还发现ADM+GBMAN具有显著的分化潜力，表明在这一阶段中性粒细胞的分化发生了转变（图2C）。最后，使用Cytotrace2算法，本研究确认MNDA+GBMAN的干性评分随着其向VEGFA+GBMAN的分化逐渐降低（图2D），这一发现也得到了VECTOR算法的进一步证实。TANs可以采用两种表型：N1或N2。N2表型被认为是免疫抑制性的，并在促进肿瘤生长中起到作用。使用ssGSEA算法，本研究观察到VEGFA+GBMAN具有较高的N2评分（图2E）。为了阐明功能动态，本研究将具有不同表达模式的基因聚类为四个阶段，并进行了GO（BP/CC/MF）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析（图2F）。这些分析揭示了中性粒细胞最初参与防御和免疫反应，TNF通路被激活以发挥细胞毒效应。随着时间的推移，细胞迁移变得更加突出，受配体活性的驱动，最终出现了白细胞迁移特征，表现出明显的缺氧特征。
接着，本研究进行了一阶导数拟合，以得出一个曲线，展示了伪时间中分化潜力的变化。二阶导数分析确定了三个关键的伪时间点，这些点代表了中性粒细胞分化潜力的显著变化（图2G）。这三个关键点分别是：（1）快速分化的初期阶段，（2）由特定因素引起的分化变化，和（3）第二个加速分化阶段。这些发现表明，中性粒细胞的重编程在ADM+GBMAN阶段具有关键作用。最后，本研究使用ssGSEA通过标志基因集对每个细胞进行评分，并拟合数据以追踪变化（图2H）。本研究观察到，在逐渐增加的缺氧和糖酵解条件下，干扰素-γ和炎症反应最初在ADM+GBMAN阶段上升，之后迅速下降。这表明，GBMANs最初有助于促炎和抗肿瘤反应，但随着缺氧和糖酵解的加剧，它们最终被重编程为免疫抑制性的VEGFA+GBMAN。
细胞间通信和细胞因子介导的GBMAN亚群与其他细胞之间的转化利用中性粒细胞免疫因子反应数据，本研究进行了矩阵相似性分析，发现ADM+GBMAN的形成主要受到IL18和IL36a等因子的刺激，而VEGFA+GBMAN则主要受到IL1a、IL1b、IL18和TNFa的触发（图3A）。接下来，通过使用CellChat分析，本研究识别了细胞间通信模式，并比较了不同组之间通信强度（图3B）。结果表明，所有亚群与基质细胞（如CAF和内皮细胞）的相互作用更强，其次是肿瘤细胞和巨噬细胞。在从MNDA+GBMAN分化到VEGFA+GBMAN的过程中，本研究观察到，当TANs作为源细胞时，SELL-CD34/PODXL轴对内皮细胞的作用呈下降趋势，而VEGFA-VEGFR1/VEGFR2轴则逐渐增强。此外，HBEGF-EGFR轴在肿瘤细胞中显示出越来越强的激活作用。在其他髓系和淋巴细胞中，MIF-(CD74 + CXCR4)和MIF-(CD74 + CD44)轴在VEGFA+GBMAN中尤为显著。当TANs作为受体细胞时，来自多个细胞源的多个轴，如SPP1/FN1/COL1A1-CD44和ANXA1-FPR1/FPR2，在ADM+GBMAN中显著突出（图3C），这表明这些受体-配体对可能在推动VEGFA+GBMAN的转化和促进免疫抑制功能方面起着关键作用。
鉴于VEGFA+GBMAN具有强烈的免疫抑制特性，本研究进一步通过整合细胞间途径和细胞内子网络（配体-受体-转录因子-靶基因）（图3D-F）来研究其对其他细胞的影响。该分析结合了细胞类型特异性的基因表达、先前的网络信息和统计推断，揭示了VEGFA+GBMAN主要通过VEGFA、SPP1和PLAU等配体影响ITGB1。此相互作用影响HIF1A和TWIST1等转录因子，从而激活SERPINE1等靶基因，促进基质细胞的ECM重塑和血管生成，并通过肿瘤细胞促进免疫逃逸。此外，VEGFA和HBEGF等配体与EGFR相互作用，激活STAT1和ETV4等转录因子，进而激活CCND2等靶基因的表达，促进肿瘤细胞的生长和发育。
为了探讨不同GBMAN亚型的表观遗传特征，本研究首先评估了它们的基因组稳定性。本研究的研究结果显示，从MNDA+GBMAN到VEGFA+GBMAN，基因组不稳定性逐渐降低（图4A），表明抗肿瘤免疫反应的抑制逐渐增强，并且由于外部干预而发生功能性改变的可能性减少。识别能够诱导和维持这些细胞状态的关键基因调控网络（GRNs）可能为GBMAN的重编程提供新的策略。本研究采用SCENIC分析并对转录因子（TF）活性矩阵进行主成分分析（PCA）（图4B），结果显示MNDA+GBMAN与VEGFA+GBMAN之间有明显的区别。这表明四个GBMAN亚型之间转录调控特征逐渐发生分化。进一步分析识别了每个亚型的特定转录因子（图4C）。在原发组中，MNDA+GBMAN与CREB5和FOXP1相关，LGALS1+GBMAN与BHLHE41和CEBPE相关，ADM+GBMAN与SRF和STAT4相关，VEGFA+GBMAN与KLF10和SREBF1相关。在复发组中，MNDA+GBMAN与ZNF217和KLF7相关，LGALS1+GBMAN与RUNX3和POLE4相关，ADM+GBMAN与NFAT5和EGR2相关，VEGFA+GBMAN与ZNF432和ATF2相关。
为了评估GRNs对GBMAN亚型在原发期和复发期途径变化的影响，本研究
对每个GBMAN亚型的差异表达基因进行了GSEA分析。然后，本研究基于转录因子-靶基因集分析了富集的基因（图4D-G）。本研究的分析显示，ZBTB14通过调控如DIRC3等基因上调了原发性MNDA+GBMAN中的KRAS信号通路。此外，STAT1通过调控SLC39A7等基因下调了复发性LGALS1+GBMAN中的干扰素-α反应通路，同时也通过调控TAP1下调了复发性ADM+GBMAN中的MYC靶基因V1通路。SPI1被发现通过靶向CXCR1和CCNL2等基因下调了复发性ADM+GBMAN中的补体通路。这些结果表明，原发性和复发性GBMAN之间的基因调控网络存在显著差异，并且四个亚型之间的网络也存在显著变化，每个网络都主宰着独特的功能。
这项研究利用大规模单细胞RNA测序（scRNA-seq）识别了不同的GBMAN亚群，分析了它们的发育轨迹、通信模式和调控网络。研究特别关注了VEGFA+GBMAN在促进免疫抑制肿瘤微环境（TME）中的作用，并绘制了GBMAN的蓝图。随后，采用机器学习技术开发了VNRS模型，最终构建了一个新的预后模型，该模型在现有的胶质母细胞瘤（GBM）风险模型中表现出较为优越的预测性能。VNRS不仅作为一个独立的预后因素来预测总生存期（OS），还在评估免疫疗法反应和化疗效果方面具有重要价值。本研究为理解中性粒细胞在GBM微环境中的作用提供了关键见解，并强调了GBMAN在其中未被充分重视的重要性。本研究揭示了这些亚群之间显著的转录差异，表明它们在TME中的潜在功能多样性。VNRS模型为指导个性化治疗、改善GBM患者的治疗效果提供了有前景的工具，并为新的免疫疗法策略的开发开辟了道路。
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