开发与治疗性蛋白结合的大环配体通常依赖资源密集型的大规模筛选方法，且难以控制结合模式。尽管蛋白设计取得进展，目前尚无稳健的方法实现从头设计蛋白结合大环分子。研究人员在此提出了RFpeptides——一种基于去噪扩散模型的设计流程，用于构建靶向特定蛋白的大环结合物。研究人员对四种不同蛋白靶点各测试了不超过20个设计分子，均获得了中到高亲和力的结合物。其中，针对Rhombotarget A（RbtA）的设计在仅依赖预测结构的前提下，仍获得了高亲和力结合物（Kd < 10 nM）。针对MCL1、GABARAP和RbtA的晶体结构与设计模型高度一致，主链均方根偏差小于1.5 Å。RFpeptides为快速、定制化开发用于诊断和治疗的大环肽提供了强有力的工具框架。
大环肽作为介于小分子药物与大分子生物药之间的一类化合物，在药物开发中展现出巨大潜力。生物药尽管具有较高亲和力和选择性，但因体积大、电荷高，难以穿越细胞膜，仅适用于胞外靶点；而小分子药物虽然可作用于胞内靶点，却难以精准结合缺乏深疏水口袋的蛋白。理论上，大环肽因尺寸适中，既有利于细胞穿透，也具备与蛋白界面结合的可能性，是调节传统药物难以触及靶点的理想候选。
然而，传统大环肽的开发方式多依赖天然产物筛选或展示技术筛选数万亿随机肽段，这些方法不仅合成困难、筛选耗时且依赖大量资源，还难以同时优化结合、选择性和细胞膜通透性等多种生物理化性质。
结构引导设计为此提供了替代思路，可通过计算探索更大范围的化学空间来快速开发特定靶点的大环肽结合物。虽然此前已有物理建模方法用于稳定大环设计，但其在蛋白结合大环方面表现有限，通常亲和力不高，且实验结构与设计模型偏差较大，限制了其在新靶点上的应用。
近年来，生成式深度学习方法取得突破，研究人员认为可将其用于构建鲁棒的大环肽设计框架。尽管现有扩散模型如RFdiffusion在蛋白设计中表现出色，但并未针对大环肽设计进行专门优化。为克服这一挑战，研究人员在RoseTTAFold2（RF2）和RFdiffusion中引入了“循环位置编码”，以支持大环主链的建模和生成。
研究人员在RF2结构预测网络中引入循环相对位置编码，可稳定预测已知天然大环肽的结构。借助该机制，RFdiffusion也可成功生成多样性丰富的大环主链结构，且不依赖D-氨基酸稳定。结合ProteinMPNN实现序列设计，并通过Rosetta优化结合界面和整体结构质量，研究人员构建了完整的RFpeptides流程。
针对抗癌靶点MCL1，研究人员设计了约1万个大环主链，筛选后合成并测试了14种设计，其中3种表现出与MCL1结合能力，最佳设计MCB_D2的结合常数为2 µM。其晶体结构与设计模型一致性高（主链r.m.s.d.为0.7 Å）。
随后，研究人员又对MDM2进行设计，筛选出11种结构多样的候选，最终获得3种有活性的结合物，最佳设计MDB_D8的Kd为1.9 µM。
为验证对非α螺旋口袋结构的适应性，研究人员选择了GABARAP作为靶点，设计了约8万个模型，筛选出13个代表性设计用于实验。合成后测试发现GAB_D8和GAB_D23分别以6 nM和36 nM的亲和力与靶标结合。X-ray 晶体结构进一步证实其与设计模型高度一致，且具备破坏GABARAP-K1相互作用的能力，GAB_D8为目前已知亲和力最高的大环GABARAP结合物。
研究人员进一步挑战了无实验结构的新靶点——RbtA（来自鲍曼不动杆菌的细胞膜蛋白），在仅基于AF2/RF2预测结构的前提下，利用RFpeptides进行设计。最终获得高亲和结合物RBB_D10（Kd = 9.4 nM），其X-ray结构与设计模型主链偏差仅1.4 Å。此结果强调了该方法在缺乏高质量结构信息场景中的适用性。
研究人员开发的RFpeptides展示了深度学习驱动的大环肽从头设计方法的强大能力。仅使用少量设计候选（每个靶点不超过20个），即获得了多个高亲和结合物（Kd < 10 nM），且无需后续实验优化。这一成功率远高于传统库筛选策略。
相比之下，RFpeptides具备以下优势：
靶向性强：可指定结合位点设计靶向分子；
结构精度高：设计模型与X-ray结构高度一致，为后续优化提供可靠模板；
灵活性强：不依赖已知配体信息，可处理多种结构类型和表面形态的靶点；
扩展性好：未来可整合非天然氨基酸、交联子与细胞穿透性优化模块。
未来结合高通量筛选与改进的筛选阈值设定，RFpeptides有望广泛应用于新型大环药物和工具分子的快速开发。
Rettie, S.A., Juergens, D., Adebomi, V. et al. Accurate de novo design of high-affinity protein-binding macrocycles using deep learning. Nat Chem Biol (2025).
https://doi.org/10.1038/s41589-025-01929-w
