David Baker | 深度学习从头设计半胱氨酸配位钴卟啉人工酶，实现高效高选择性 CO₂光催化还原

本文基于 2026 年 5 月发表于 bioRxiv 的预印本论文，系统介绍研究团队依托深度学习蛋白质设计技术，构建高热稳定性从头设计 CO₂还原酶的完整工作，涵盖设计思路、实验方法、关键结果与科学结论，严谨呈现人工金属酶催化 CO₂转化的突破性进展。

一、研究背景与设计思路

大气中 CO₂浓度持续升高是全球变暖的核心驱动因素，开发高效、高选择性的 CO₂转化催化技术是实现碳中和的关键路径。传统均相、多相 CO₂还原催化剂虽催化速率较高，但普遍存在稳定性差、选择性不足的问题，难以区分 CO₂还原与质子还原产氢的竞争路径；天然 CO₂转化酶虽效率与选择性优异，却存在稳定性有限、表达与表征难度大、催化机制未完全解析等缺陷。

基于此，研究团队提出从头设计人工金属酶的研究策略，以高热稳定的人工蛋白为支架，搭载非天然钴原卟啉 IX（CoPPIX）辅因子，结合深度学习蛋白质设计方法，构建结构多样、活性位点可精准调控的 CO₂还原酶，既规避天然酶的稳定性短板，又突破传统催化剂的选择性瓶颈。团队前期已实现组氨酸配位铁卟啉的从头设计过氧化物酶、卡宾转移酶，掌握卟啉高亲和力结合的设计规律，结合 RFdiffusion All‑Atom、LigandMPNN 等 AI 设计工具，可创造远超天然存在的活性位点几何构型与辅因子配位环境，为定制化 CO₂还原酶设计提供技术支撑。

二、第一代从头设计 CO₂还原酶的构建与表征

研究团队以高热稳定的 α‑螺旋 solenoid 蛋白 dnHEM1 为起始模板，该蛋白通过轴向组氨酸配体高亲和力结合铁原卟啉 IX（FePPIX）。为实现 CoPPIX 的体内组装，团队采用培养基补充钴盐的体内辅因子生物合成策略，无需体外辅因子替换，大幅降低实验成本与操作复杂度。纯化后的 CoPPIX‑dnHEM1 紫外‑可见光谱在 422 nm 处出现特征 Soret 峰，与 FePPIX‑dnHEM1 的 402 nm 特征峰存在明显偏移，证实 CoPPIX 成功整合。

光催化活性测试以 [Ru (bpy)₃]²⁺为光敏剂、抗坏血酸钠为牺牲还原剂、碳酸氢钠为 CO₂源，475 nm 蓝光照射 30 分钟，气相色谱检测顶空气体。结果显示，dnHEM1 可催化生成 220 ppm CO（30 分钟转化数 94），同时伴随 424 ppm H₂产生，选择性较低。为提升催化性能，团队筛选 dnHEM1 突变体库，获得dnHEM1.2B（V11R/D39H/A47R），其 CO₂还原活性较原型提升 2.6 倍，30 分钟转化数达 241，但选择性与原型无显著差异。

图 1 第一代从头设计 CO₂还原酶的开发本部分系统完成第一代酶的骨架筛选、辅因子组装、活性优化，明确组氨酸配位骨架的催化潜力与选择性短板，为后续广谱设计奠定基础。

三、高性能 CO₂还原酶的高通量设计与筛选

在第一代酶基础上，研究团队拓展设计策略，构建包含组氨酸 / 半胱氨酸轴向配位、多样蛋白拓扑结构的人工卟啉结合蛋白库，采用五大设计流程：ProteinMPNN 对 dnHEM1.2B 进行序列重设计、NTF2 支架引入血红素结合位点、ProteinMPNN 联合 RFjoint2 inpainting 生成肌红蛋白序列同源物、RFjoint2 inpainting 向 dnHEM1 引入半胱氨酸配体、RFdiffusion All‑Atom 从头生成全新蛋白骨架。所有设计经 AlphaFold2 结构预测、Rosetta 蛋白‑配体界面质量评估后，选取 69 条序列、26 种独特折叠进行实验验证。

69 条设计序列中，67 条可在大肠杆菌中可溶性表达并经镍亲和层析纯化，63 条呈现 CoPPIX 结合的特征紫外‑可见光谱（Soret 峰 420–435 nm）。光催化筛选结果显示，基于 dnHEM1.2B、肌红蛋白的序列重设计未实现活性突破，RFdiffusion All‑Atom 生成的半胱氨酸配位设计表现最优，筛选出 11 个活性优于 dnHEM1.2B 的结构多样突变体。其中 A4、B6 兼具高活性与纯化稳定性，且与天然蛋白无结构同源性（TM 评分分别为 0.54、0.56），成为核心研究对象。

图 2 从头设计 CO₂还原酶的设计与筛选高通量设计与筛选证实，半胱氨酸配位、AI 从头生成的全新蛋白骨架是提升 CO₂还原性能的关键，突破天然蛋白骨架的结构限制。

四、A4 与 B6 的理化性质与催化性能表征

经优化表达与纯化（镍亲和层析 + 尺寸排阻色谱），获得均一的 CoPPIX 负载 A4、B6 单体酶。光谱表征显示，A4 的 Soret 峰位于 434 nm，Q 带为 542 nm、577 nm；B6 的 Soret 峰位于 422 nm，Q 带为 533 nm、563 nm。ICP‑OES 检测无铁杂质，确定两者摩尔吸光系数分别为 104.4、97.4 mM⁻¹・cm⁻¹。热稳定性测试表明，A4、B6 均为超高热稳定酶，熔融温度 Tm＞95 ℃，25–95 ℃范围内圆二色光谱无明显变化，95 ℃下仍保持辅因子结合能力，稳定性远超天然酶与传统人工催化剂。

催化性能对比显示，以碳酸氢钠为 CO₂源时，A4、B6 的 CO₂还原活性较 dnHEM1 提升 3.6–3.7 倍，CO 选择性从 35% 提升至 75%，显著抑制产氢副反应；替换为纯 CO₂气体底物后，性能进一步优化，选择性＞84% ，A4、B6 的催化速率分别达 25 min⁻¹、18 min⁻¹，总转化数均突破 1000，实现高活性、高选择性、高转化数的协同优化。

图 3 设计蛋白 A4 与 B6 的表征理化与催化数据证实，半胱氨酸配位的 AI 设计酶，在活性、选择性、稳定性三大核心指标上全面超越组氨酸配位的原型酶。

五、晶体结构解析与关键氨基酸功能验证

研究团队成功解析 A4 的 2.1 Å 高分辨率晶体结构（PDB：9T8A），结构与设计模型、AlphaFold2 预测模型高度吻合，主链 RMSD 为 1.05 Å。CoPPIX 辅因子位于溶剂屏蔽口袋（溶剂可及表面积 12 Ų，远低于 dnHEM1 的 112 Ų），Cys98 按设计实现轴向配位，精准构建半胱氨酸‑钴配位中心；设计中用于结合 CoPPIX 丙酸根的 His73，在晶体结构中占据空配位点形成六配位结构，导致卟啉轻微偏转。

为明确关键残基功能，团队构建 C98A、H73A 单点突变体。功能实验显示，Cys98 突变为丙氨酸后，CoPPIX 结合能力、催化活性与选择性显著下降，证实半胱氨酸轴向配位是催化核心；His73 突变为丙氨酸后，催化性能无明显变化，且 1.8 Å 分辨率的 A4 H73A 晶体结构（PDB：9T8B）显示，辅因子恢复五配位催化活性态，卟啉平面与 Cys98 配位构象更贴合设计模型。

图 4 A4 与 A4 H73A 的结构分析结构与突变实验明确了活性中心的构效关系，半胱氨酸配位、五配位活性态是实现高效 CO₂还原的结构基础。

六、研究结论与展望

本研究成功依托深度学习蛋白质设计技术，从头构建半胱氨酸配位 CoPPIX 的高热稳定人工 CO₂还原酶，核心结论如下：