2026年6月17日，四川大学华西医学院的张岚和王贯研究团队在JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY上发表了题为Integrating Machine Learning and Structure-Guided Discovery of a Novel Type II SYK Inhibitor for Treating Triple-Negative Breast Cancer的文章。

在这篇文章中，研究团队通过整合机器学习辅助的虚拟筛选与结构导向的药物设计策略，针对三阴性乳腺癌治疗中SYK激酶抑制剂的开发难题，利用随机森林算法对分子对接评分函数进行后校正以降低假阳性率，并基于SYK的DFG-out非活性构象与αC-螺旋变构位点的结构特征进行优化设计，成功开发出首个强效II型SYK抑制剂5i。该化合物对SYK表现出优异的抑制活性和出色的激酶选择性，并能有效稳定SYK的DFG-out非活性构象。

体外活性方面，化合物5i在SYK激酶抑制实验中展现出强效的抑制能力：对野生型SYK的IC₅₀为16 nM，阳性对照R406的IC₅₀为43.0 nM。在390种人激酶面板中，1 μM 浓度下5i对除SYK外的所有激酶抑制率均低于30%，仅对FGFR2（27%）、CK2（26%）、ATR/ATRIP（25%）、LRRK2（24%）、CSNK1A1L（23%）和EPHB1（21%）有较弱抑制活性，展现出优异的激酶选择性。抗增殖活性方面，对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT-549和MCF-7的IC₅₀分别为1.1 μM、1.6 μM和2.1 μM（48小时处理）。对下游信号轴的抑制表现为PLC-γ-1的SYK磷酸化底物Tyr783磷酸化水平显著下降，并诱导Bax上调、Bcl-2下调、Caspase-3和PARP裂解促进细胞凋亡。

在体内实验中，化合物5i在雌性BALB/c裸小鼠建立的MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中每日一次腹腔注射10或20 mg/kg，连续14天耐受良好，各组体重无显著变化。低剂量组（10 mg/kg）实现显著肿瘤生长抑制，高剂量组（20 mg/kg ）抑制效果更强，肿瘤重量和体积均显著降低，呈现剂量依赖性。肿瘤组织Western blot分析证实Cleaved-caspase 3和Bax上调、Bcl-2下调，MMP-2下调、E-cadherin上调；免疫组化显示Ki67和Bcl-2显著降低、Cleaved Caspase-3显著升高、MMP-2显著降低，表明5i在体内有效抑制增殖、诱导凋亡并减弱迁移蛋白表达。药代动力学分析显示，静脉注射1.0 mg/kg后血浆半衰期3.32 h、清除率564.66 mL/min/kg、表观分布容积4256.25 mL/kg，但口服10 mg/kg后生物利用度极低（Cmax = 4.56 ng/mL），提示存在显著的胃肠道吸收障碍或首过效应，需进一步优化口服生物利用度。

脾脏酪氨酸激酶（Spleen Tyrosine Kinase, SYK）是一种分子量约72 kDa的非受体型蛋白酪氨酸激酶，属于SYK/ZAP-70家族成员，其结构特征包括N端的两个串联SH2结构域和C端的一个酪氨酸激酶结构域，最初被认为主要在适应性免疫信号转导中发挥核心作用，在B细胞和T细胞中通过其SH2结构域与免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）结合来介导下游信号级联，调控细胞增殖、分化、吞噬作用和存活，对B细胞从祖B细胞到成熟B细胞的发育过渡、抗体产生以及肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等先天免疫细胞的功能至关重要，但近年来的研究已将其功能拓展至更广泛的生物学过程，包括调控整合素介导的细胞黏附、血管发育、血小板激活与血栓形成、破骨细胞成熟以及急性和慢性炎症反应。

在癌症中，SYK在不同癌症类型中既可作为抑癌基因也可作为促癌基因。在抑癌方面，SYK在黑色素瘤、肝细胞癌、胃癌和胰腺癌等多种实体瘤中表达下调或缺失，常因启动子甲基化或等位基因丢失导致，其重新表达可抑制上皮-间质转化（EMT）、阻断细胞侵袭和迁移并维持细胞间黏附，从而抑制肿瘤生长和转移。然而在促癌方面，SYK在血液系统恶性肿瘤中扮演关键促癌角色，在弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等B细胞肿瘤中，SYK通过维持B细胞受体的信号激活PI3K/AKT 、ERK等下游通路来维持细胞存活；在急性髓系白血病中，SYK被β3-整合素激活以促进白血病细胞生长；在肺癌腺癌、卵巢癌、甲状腺乳头状癌和胶质瘤等实体瘤中，SYK过表达则促进肿瘤生长、侵袭和化疗耐药。最新研究还发现，肿瘤细胞中的SYK表达可通过TNF-α依赖性信号调控肿瘤免疫微环境，SYK抑制不仅能减少肿瘤生长和转移，还可增强CD8+ T细胞反应和促炎细胞因子产生，提示其抑制剂可能具有免疫刺激抗癌作用。基于这些机制，SYK已成为重要的药物靶点，Fostamatinib等口服抑制剂已在血液肿瘤的临床试验中显示疗效，并获批用于免疫性血小板减少症，而Entospletinib等新一代抑制剂也在持续开发中，但由于SYK的双重作用，治疗策略需根据癌症类型精准设计，针对高表达SYK的血液肿瘤使用抑制剂阻断促癌信号，而对SYK缺失的实体瘤则需探索恢复其抑癌功能的策略。

图1.先前已经报道的SYK抑制剂的结构。

在整个研究过程中，作者首先针对传统分子对接评分函数假阳性率高的问题，开发了机器学习辅助的后对接校正模型，并建立了多层虚拟筛选工作流程。具体而言，研究团队构建了一个包含322个实验确认的SYK抑制剂（IC₅₀ < 2 μM）作为阳性数据集，并利用DUD-E生成1500个在分子量、电荷状态和cLogP上匹配但拓扑结构不同的诱饵分子作为阴性数据集（图2A）。随后将这些化合物进行分子对接，提取13个对接衍生描述符（包括CDOCKER能量相关统计、CDOCKER相互作用能量统计、氢键计数、π-π堆积计数、盐桥计数和构象计数）构建特征矩阵。接下来，研究团队比较了随机森林（RF）、XGBoost、支持向量机（SVM）和朴素贝叶斯四种机器学习算法，其中随机森林模型表现最优（AUC = 0.75），显著优于原始CDOCKER评分（AUC = 0.67）（图3A-C）。图3D的二维决策边界可视化以CDOCKER最小能量和最小相互作用能量为输入特征，清晰区分了活性化合物（红色）和非活性化合物（蓝色）。特征重要性分析显示氢键计数、盐桥计数和CDOCKER最小能量在模型识别能力中发挥关键作用（图3E）。基于该ML 校正模型，研究团队建立了多层虚拟筛选工作流程（图2B）：从30万个结构多样性化合物出发，依次经过Lipinski规则过滤（103,000个）、LibDock快速刚性筛选（1,637个）、CDOCKER精细对接（300个）、SwissADME药代预测（20个），最终经ML复确认获得11个阳性化合物。图3F的实验验证结果显示，这11个化合物中有7个在1 μM浓度下对SYK抑制率超过50%，其中L-5活性最为突出，R406作为阳性对照显示91.3%的抑制率。该ML校正模型显著提高了虚拟筛选的精度和区分能力，为后续大规模化合物库筛选及先导化合物的发现提供了可靠的预测工具。

图2.机器学习辅助的对接评分校正与虚拟筛选工作流程

图3.机器学习模型性能评估与先导化合物验证

接下来，作者团队基于发现的先导化合物L-5，采用三轮递进式改造策略，系统优化出II型SYK抑制剂5i。第一轮优化（化合物4a-n，图4A）： 保留L-5的苯并咪唑母核（与铰链区Asn499双氢键结合），在 R1位引入取代基填充疏水空腔。其中4n的3,4,5-三甲氧基苯基通过构象限制效应进入DFG-out口袋后方区域，活性最优（IC₅₀ = 277.2 nM），MM-PBSA证实其偏好DFG-out构象。第二轮优化（化合物5a-n，图4B）： 在4n基础上保留三甲氧基苯基R1，将R2位吗啉环替换为N-甲基哌嗪，旨在与αC-螺旋Glu420形成氢键以锁定αC-out构象。5i由此诞生：苯并咪唑母核与Phe513形成π-π堆积/π-阳离子相互作用锁定DFG-out；N-甲基哌嗪与Glu420氢键结合，使Lys402-Glu420盐桥距离增至3.75 Å，αC-螺旋外旋>15°，稳定非活性态。5i与SYKDFG-out结合自由能（-55.38 kcal/mol）显著低于DFG-in（-41.65 kcal/mol），活性达IC₅₀ = 16 nM。反例5n（R2为苯氨基）活性骤降（抑制率35.3%），证明Glu420处精确定位至关重要。第三轮优化（化合物6a-m，图4C）： 尝试在苯并咪唑4位引入取代基与残基Met448作用，但 6h/6j因空间冲突被推离铰链区，证实4位不宜取代。

综上，作者团队通过"苯并咪唑铰链结合—三甲氧基苯基稳定DFG-out—N-甲基哌嗪锁定αC-out"三重作用机制，成功开发出强效II型SYK抑制剂5i。

图4.结构引导的化合物改造历程

接下来，作者团队对优化得到的先导化合物5i进行了系统的体外活性表征与作用机制验证（图5）。5i对SYK的IC₅₀为16 nM，显著优于阳性对照R406（43.0 nM）。相互作用分析显示，5i与SYKDFG-out在自由能最小值处形成三组氢键：苯并咪唑母核与铰链区Asn499/Glu449结合，N-甲基哌嗪与αC-螺旋Glu420形成关键氢键，同时与Phe513存在π-π堆积和π-阳离子相互作用（图5A-B）。100 ns MD模拟显示，5i及5i -SYKDFG-out复合物的RMSD均保持小而稳定，蛋白骨架一致性良好；结合自由能景观图显示仅存在一个最低能量状态，表明SYK被锁定在单一非活性构象；氢键数量在整个模拟过程中维持2-3个，为抑制活性提供关键基础（图5C-E）。Western blot显示，5i剂量依赖性抑制TNBC细胞（MDA-MB-231和BT-549）中SYK下游底物PLC-γ-1的Tyr783磷酸化，证实其有效阻断SYK信号通路（图5F）。DARTS实验表明，5i以浓度依赖性方式保护SYK免受Pronase降解，证明其与SYK的直接结合；细胞热迁移实验（CETSA）显示，5i显著增强MDA-MB-231和BT-549细胞中SYK的热稳定性，进一步验证其细胞内靶标结合能力（图5G-I）。

综上，作者团队通过酶学活性、分子模拟、细胞信号通路及靶标结合等多维度实验，确证了5i作为强效II型SYK抑制剂的体外活性与作用机制。

图5.化合物5i的体外活性表征与作用机制验证

接下来，作者团队为深入阐明5i的II型结合机制，对SYK激酶的动态构象变化进行了系统的分子动力学模拟与能量分解分析（图6）。图6A的能量分解结果显示，DFG基序中的Phe513和αC-螺旋中的Glu420对5i的结合贡献最为显著，解释了其对DFG-out构象的更高亲和力，门控残基Met448同样做出了实质性贡献，鉴于Phe513和Glu420既是药物靶标结合的关键氨基酸，也是决定SYK是否处于非活性状态（即DFG-out）的决定性位点，研究团队进一步开展了单点突变模拟，自由能计算揭示F513A或E420A突变均显著降低药物靶标亲和力，且化合物对SYKDFG-in的亲和力明显低于SYKDFG-out，展现出典型的II型抑制剂特征（图6B），此外，与Apo SYKDFG-out相比，5i的结合显著稳定了DFG区域（510-515位氨基酸）的残基波动，其稳定能力优于先导化合物L-5（图6C），图6D进一步对比分析了SYKDFG-in与SYKDFG-out的构象差异，两者的主要区别在于Phe513侧链取向（二面角χ1）和αC-螺旋的外旋程度，研究团队比较了Apo SYKDFG-out、Apo SYKDFG-in和Holo（5i结合）状态下 Phe513侧链χ1二面角的动态变化，观察到5i有效将Phe513锁定在外旋构象状态（图6E），αC-螺旋外旋程度是激酶活性的另一关键指标，具体而言，在αC-in状态下，β3链上的Lys402与αC-螺旋上的Glu420形成盐桥（K-E距离约2.9 Å），维持其内旋并将SYK置于活化构象，而在αC-out状态下，K-E盐桥断裂，距离增至约3.5 Å，αC-螺旋发生约17°外旋，分析显示5i可与Glu420形成氢键，使Lys402与Glu420距离增至约3.75 Å，阻止K-E盐桥形成（图6F），αC-螺旋的外旋程度也维持在较高水平（相对倾斜角>15°）（图6G），这些数据从原子水平上确证了5i通过同时锁定DFG-out构象和αC-out构象的双重机制，实现对SYK非活性状态的稳定化，从而发挥其强效II型抑制作用。

图6.化合物5i 的SYK II型结合机制

随后，作者团队对化合物5i进行了广泛的激酶选择性评价，以验证其作为II型抑制剂因结合DFG-out构象中保守性较低的疏水后口袋而可能获得的选择性优势（图7）。基于390种人激酶面板实验，1 μM浓度的5i对除SYK外的所有激酶抑制率均未超过30%，展现出优异的广谱选择性。具体而言，5i仅对6种激酶显示>20%的抑制活性，包括成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2，27%）、酪蛋白激酶2（CK2，26%）、共济失调毛细血管扩张症及Rad3相关蛋白/ATR互作蛋白（ATR/ATRIP，25%）、富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（LRRK2，24%）、酪蛋白激酶1α1样蛋白（CSNK1A1L，23%）和ephrin B型受体1（EPHB1，21%）。S-score（35）选择性评分仅为0.003，表明 5i具有极高的激酶组选择性。这一优异的选择性归因于5i独特的II型结合模式：通过稳定DFG-out非活性构象并占据ATP结合位点后方新暴露的疏水口袋，该区域的残基在进化上保守性远低于ATP结合位点本身，从而有效规避了经典I型抑制剂面临的ATP口袋保守性难题。

图7.5i的广泛激酶选择性评价

接下来，作者团队为评估5i对三阴性乳腺癌细胞的抗肿瘤增殖效应，系统开展了克隆形成实验和EdU掺入实验（图8），在克隆形成实验中，5i以2.5 μM、5 μM和10 μM浓度处理MDA-MB-231和BT-549细胞后，显著抑制了细胞的克隆形成能力，与对照组相比，5i处理组的克隆数量和大小均呈剂量依赖性减少，阳性对照R406（10 μM）产生相似的抑制效果，定量分析显示5i处理组的克隆数量百分比显著低于对照组（图8A-B），在EdU掺入实验中，5i 同样以剂量依赖性方式显著减少了MDA-MB-231和BT-549细胞中DNA合成阳性细胞的比例，与对照组相比，5i（2.5 μM、5 μM、10 μM）处理组的EdU阳性细胞百分比逐步降低，R406（10 μM）作为阳性对照也显示出明显的抑制作用，代表性荧光图像和定量分析均证实了这一效应（图8C-F），具体数据显示，在MDA-MB-231细胞中，对照组EdU阳性率接近100%，而5i 10 μM处理组降至约30%以下，BT-549细胞中也呈现类似的剂量依赖性下降趋势，这些结果表明化合物5i能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞的DNA合成和长期增殖能力，且其抗增殖活性与SYK激酶抑制活性呈正相关，为后续体内抗肿瘤实验奠定了细胞水平的药效学基础。

图8.5i对三阴性乳腺癌细胞的抗肿瘤增殖效应研究

作者团队为评估5i对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的抑制作用及其分子机制，系统开展了划痕愈合实验、Transwell迁移实验以及上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达分析（图9 ），在划痕愈合实验中，5i以剂量依赖性方式显著抑制了MDA-MB-231和BT-549细胞的迁移能力，与对照组相比，5i处理组24小时后的伤口愈合率明显降低，阳性对照R406（10 μM）产生相似的抑制效果，定量分析显示5i处理组的伤口闭合百分比显著低于对照组（图9A-B），在Transwell迁移实验中，5i处理组穿过膜的细胞数量较对照组显著减少，进一步证实其抗迁移活性（图9C-D），为探索潜在机制，研究团队检测了EMT标志蛋白的表达变化，Western blot分析显示，5i以剂量依赖性方式上调上皮标志物E-cadherin的表达，并下调转移相关蛋白酶MMP-2的表达，这一调控效应在MDA-MB-231和BT-549细胞中均得到验证（图9E-F），免疫荧光染色进一步在细胞水平直观证实了该调控作用，显示5i处理后E-cadherin信号增强而MMP-2信号减弱（图9G-J），这些数据表明化合物5i通过逆转EMT表型有效抑制三阴性乳腺癌细胞迁移，为理解其抗肿瘤转移机制提供了直接证据。

图9.5i对三阴性乳腺癌细胞的迁移能力抑制作用研究

最后，作者团队为评估5i的体内抗肿瘤疗效，在雌性BALB/c裸小鼠建立的MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中开展了为期14天的给药实验（图10），实验设置四个处理组：溶媒对照组、5i低剂量组（10 mg/kg，腹腔注射）、5i高剂量组（20 mg/kg，腹腔注射）以及阳性对照Fostamatinib组（20 mg/kg，腹腔注射），每组7只小鼠，治疗结束后，肿瘤的代表性图像直观显示5i处理组肿瘤体积明显小于对照组（图10A），定量分析表明，5i高剂量组的肿瘤重量显著低于对照组和低剂量组，呈现清晰的剂量依赖性抗肿瘤效应（图10B），肿瘤体积变化的时间曲线显示，从第0天至第14天，5i高剂量组的肿瘤生长速率持续低于其他各组（图10D），对照组和5i 10 mg/kg组100%为疾病进展（肿瘤增大≥20%），5i  20 mg/kg组58%为PD、14%为疾病稳定（肿瘤变化<20%至<30%减少）、28%为部分缓解（肿瘤缩小≥30%），Fostamatinib 20 mg/kg组44%为PD、28%为SD、28%为PR（图10C）。各组小鼠体重在整个实验期间无显著变化，表明5i在所用剂量下具有良好的耐受性，肿瘤组织Western blot分析显示，5i处理促进凋亡蛋白表达：Cleaved-caspase 3和Bax水平升高，Bcl-2水平降低；迁移相关蛋白分析显示MMP-2显著下调、E-cadherin显著上调（图10E-J），免疫组化（IHC）染色进一步验证上述结果：Ki67增殖标志物随5i剂量增加显著降低（图10K），Bcl-2表达显著下调（图10L），Cleaved Caspase-3表达显著增强（图10M），MMP-2水平显著降低（图10N），这些体内实验结果与细胞水平发现高度一致，证实5i通过抑制增殖、诱导凋亡和减弱迁移蛋白表达有效抑制MDA-MB-231异种移植瘤生长，且无显著毒性，为其作为三阴性乳腺癌治疗候选药物的继续开发提供了关键的体内药效学证据。

图10.5i的体内抗肿瘤活性研究

综上所述，本文作者围绕三阴性乳腺癌治疗中SYK激酶作为新型靶点的挖掘难题，基于机器学习辅助的虚拟筛选与结构导向药物设计策略，以随机森林算法校正对接评分降低假阳性率，从30万个化合物中筛选获得苯并咪唑先导化合物L-5，系统性地设计并合成了三系列共45个II型SYK抑制剂，最终通过结构优化策略获得代表性化合物5i。其对SYK的IC₅₀为16 nM，390种人激酶面板中除SYK外无抑制率超过30%的靶点。细胞水平对MDA-MB-231、BT-549和MCF-7的48 h IC₅₀分别为1.1 μM、1.6 μM和2.1 μM。在MDA-MB-231异种移植模型中，10与20 mg/kg每日腹腔给药14天实现显著剂量依赖性肿瘤生长抑制，20 mg/kg组28%达到部分缓解，体重无显著变化，H&E染色未见器官毒性。该研究报道了新型强效II型SYK抑制剂 5i在三阴性乳腺癌中的应用，为靶向SYK诱导HR缺陷、增强DNA损伤疗法及克服PARP抑制剂耐药的治疗策略提供了体内有效、机制明确、选择性优异的II型抑制剂范例。