SCI REP-UK | 在食物蛋白质衍生肽数据库中对胆汁酸结合肽进行机器学习筛选

撰文：钱洁

编辑：肖冉

生物活性肽（BPs）是具有多种物理、化学性质的蛋白质片段，具有与多种生物分子相互作用的潜力，被认为是新一代生物活性调节剂，是化妆品和保健食品行业有希望的候选产品。近来从可食用蛋白质中筛选出了一些对人类有积极益处的BPs，如血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性和杀菌活性等。当前肽筛选的方法中，定向进化是一种很有前途的方法。

然而，尚未发现来自可食用蛋白质的新BP片段。由于绝大多数BPs的分离、纯化和鉴定难度大，从可食用蛋白质中筛选肽仍然是一项困难的任务。新兴的用于识别新BPs的计算机模拟方法利用包含来自感兴趣蛋白质的序列，并使用生物信息学工具预测生物活性。最近的研究表明，将数据库与先进的基于机器学习的生物信息学工具相结合，是筛选和开发新型BPs的一种有希望的方法。

在本研究中，使用BIOPEP-UWM数据库（存储BPs以及可食用蛋白质、过敏性蛋白质及其表位和感觉肽以及氨基酸）和机器学习开发了一种新的策略来筛选来自可食用蛋白质的BPs。如果获得的模型具有较高的预测精度，则可以在不进行任何湿实验的情况下预测衍生的BP片段。该策略允许通过使用BIOPEP-UWM等数据库进行计算机模拟筛选，从可食用蛋白质中探索所有BPs。实验工作流程如Fig. 1所示。

Fig. 1演示实验工作流程的示意图。

阳性和阴性数据集由训练数据生成。随后，用氨基酸特征（位点特异性特征）和肽特征（全局特征）生成解释变量。使用训练数据和解释变量的组合构建预测模型。使用可食用蛋白质数据库BIOPEP-UWM创建了一个包含可食用蛋白质中发现的肽的新数据库。最后，将构建的模型应用于可食用蛋白质数据库，并对每种肽的生物活性进行了预测。

为了生成训练数据，在肽阵列中化学合成了460个4-、5-、6-和7-mer肽并通过质谱分析鉴定部分合成的多肽。使用抗胆汁酸的第一抗体和荧光标记的第二抗体评估胆汁酸和肽之间的结合能力。根据相同肽序列的三倍荧光强度确定平均荧光强度作为多肽的结合活性。在训练数据中观察到4-mer的荧光强度低于较长肽的荧光强度，可能是由于其疏水性相对较低。460个多肽中，荧光强度最高的150个多肽为胆汁酸结合活性“阳性”数据集，荧光强度最低的150个多肽为“阴性”数据集，阳性和阴性数据集的平均荧光强度如表1所示。Fig. 2中显示了所有肽的荧光强度的频率分布。5-mer的分布比其他的略宽。当肽的长度变长时，肽的疏水性逐渐增加。如表 2所示，这可能是5-mer获得高性能的原因。两个数据集之间存在显著差异（P<0.001），表明随机设计的肽库包含有不同胆汁酸结合生物活性的肽。

为了构建预测模型，选择了等电点（IP）、极性（PL）、亲水指数（HI）、分子量（MW）、螺旋指数（Ph）和转动指数（Pt）等7种氨基酸特征（AAF）用作位点特异性特征。为了解释肽的特征，AAF的偏差、最大值和最小值被生成为全局特征（GF）。计算了300个肽（阳性=150，阴性=150）的AAF和GFs等肽特征用作解释变量。使用三种算法（SVM、RF和LR）构建预测模型，并通过比较准确度、精确度和召回率来评估模型性能。概率>0.5的肽被指定为阳性，概率<0.5的肽被指定为胆汁酸结合阴性。除了5-mers和7-mers的精度分数外，所有RF分数在三种测试算法中都是最高的（表 2）。因此，选择RF作为预测算法。

4-mer肽的得分低于较长肽的得分（表 2）。将阳性数据集和阴性数据集的平均荧光强度之比定义为P/N强度比。在表 1中，4-mers的P/N强度比（2.67）低于较长肽（5-mers为3.63，6-mers为4.11，7-mers为3.87）。这是由于4-mer训练数据的整体荧光强度相对较低所致。模型性能与P/N强度比大致相关。性能差的原因是当P/N强度比较低时，所获得的模型预测的FPs和FNs数量相对较多。

为了预测肽的生物活性，定量分析肽的结构与生物活性之间的关系引起了许多物理生物化学家的兴趣。据报道，位于N端的氨基酸比位于中间端和C端的相同氨基酸更具亲水性。因此，4-肽可能比较长的肽（如5-、6-和7-肽）更具亲水性。疏水性是肽与胆汁酸强结合所必需的，而4-mer 肽与胆汁酸之间的疏水相互作用较低，其与胆汁酸结合力较低的原因也很重要。在之前的研究中，鉴定了胆汁酸结合4-mer肽，如NGLK、YEAR等。与6-mer结合肽相比，这些肽显示出类似或更高的结合活性。与长肽相比，4-mer结合肽可能表现出不同的物理化学特征。

在输入变量的重要性分析中发现，前10个选定特征中的大多数涉及肽的GFs，但两个特定特征除外：4-mers的residue2_Molecular_weight和7-mers的residue1_Isoelectric_point。此外，4-7 mers的前10个选定特征中分别有两个、四个、四个和五个特征与肽等电点有关；有五个、三个、两个和两个特征与分子量有关。这表明GFs比4-7 mers中胆汁酸结合活性的位点特异性特征更重要。胆汁酸分子是两亲性的，具有疏水性类固醇核和亲水性羟基，因此具有较强的表面活性剂作用。由于肽与胆汁酸的结合可以发生在两个方向上，因此位点特异性肽特征可能不那么重要。在输入变量中与等电点和分子量有关的的特征最重要，表明具有高等电点或高分子量的肽与胆汁酸结合强烈。因此，碱性或芳香肽对胆汁酸具有较高的结合活性。一些研究调查了胆汁酸与其他化合物之间的结合机制，并揭示了疏水性氨基酸，尤其是芳香族氨基酸，与胆汁酸胶束相互作用。这些发现与分析的前10个特征一致。

分析了多肽阵列的氨基酸残基出现频率，以验证学习数据的再现性。在阳性肽的氨基酸出现频率中，F、K、R、W和Y这五个氨基酸的出现频率较高。在阴性肽中，C、D和E这三种氨基酸相对较高，与特征重要性分析的结果一致。然而4-mers略有不同：A和G在阳性肽中相对较低，而D和E在阴性肽中相对较低。

2.3  食用肽数据库构建及胆汁酸结合活性预测

从BIOPEP-UWM中获得一组710种可食用蛋白质，并使用所有可用的预测蛋白酶结合位点进行消化（表 3），删除重复序列后，数据集包含56171个4-mers、89663个5-mers、98387个6-mers和102805个7-mers。因此，产生了大约350000个肽序列的总数据集。

所有由可食用蛋白质产生的肽序列均应用于建立的RF模型。预测结果按概率顺序排列，提取前50个阳性预测肽和后50个阴性预测肽进行化学合成并测定其胆汁酸结合活性。Fig. 3所示。测定的阳性肽的平均荧光强度高于阴性肽（P<0.001），表明RF模型可以成功预测胆汁酸结合活性。

分析测定的多肽中氨基酸残基的出现频率，以验证预测模型结果的准确性。发现3种氨基酸F、L和Y在阳性预测肽中的频率较高，W在4-mer预测肽中的频率较高， R在5-、6-和7-mer预测肽中的频率较高。阳性预测肽的不同频率可能是由于阳性肽和阴性肽之间的差异相对较小（Fig. 3）。

在数据库中贮藏蛋白质对应的胆汁酸结合活性得分最高的七种肽：豆素A（Pisum sativum）的VFWM，高分子量麦谷蛋白（Triticum aestivum）的QRIFW，来自profilin-1（Hordeum vulgare）的RVWVQ，来自血清白蛋白（Gallus gallus）的LIRYTK，来自豆素链B片段（Vicia faba）的NGDEPL，来自鸡结缔组织(titin)片段（Gallus gallus）的PTFTRKL，以及来自α-S2-酪蛋白（Bos taurus）的KISQRYQ。预测NGDEPL对胆汁酸的亲和力较低；然而，根据肽阵列测定，它具有高胆汁酸结合活性。这种明显矛盾的机制尚不清楚，但这种肽可能与胆汁酸立体特异性结合。由于贮藏蛋白质有利于制造保健食品和化妆品，因此这些蛋白质来源有望含有新的生物活性成分。

目前数据集中的大多数预测BPs是通过植物或微生物酶的蛋白水解和胃肠酶的蛋白水解获得的。因此，为了评估这些肽在工业规模上的效用，研究了从贮藏蛋白中得到的七种肽是否可以用肽酶或蛋白酶生成。因此，预计KISQRYQ由α-S2-酪蛋白（Bos taurus）和肽基赖氨酸金属内肽酶（Armillaria mellea neutral proteinase）生成。Gutiez等人先前研究了乳酸菌引起的自溶与血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽产生之间的关系，并报告了Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403从脱脂牛奶（(alpha-S2-casein）中产生KISQRYQ。综上所述，这些结果表明KISQRYQ可能是健康食品的候选BP。