本文介绍的是来自中国科学院上海药物研究所药物研究国家重点实验室的Sulin Zhang, Hong Liu和Mingyue Zheng共同通讯发表在Journal of Medicinal Chemistry上的研究成果。由于盘状结构域受体1（DDR1）的改变可能导致炎症细胞因子的增加，使DDR1成为治疗炎症性肠病（IBD）的一个靶点。作者通过整合深度生成模型、激酶选择性筛选和分子对接，建立了基于骨架的分子设计流程，产生了一种新型的DDR1抑制剂化合物2，该化合物显示出有效的 DDR1 抑制特性（IC50 = 10.6±1.9 nM) 和对一组 430 种激酶的出色选择性（S(10) = 0.002，0.1μM）。化合物2能有效地抑制细胞中促炎症细胞因子的表达和DDR1的自磷酸化，而且在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中也显示出较好的口服治疗效果。
炎症性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其特征是胃肠道中不受控制的慢性炎症。有研究表明，IBD是由对共生肠道微生物群不平衡的促炎免疫反应引发的，全球有超过400万人受此种疾病折磨。研究发现，炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(ILs)在控制肠道炎症和IBD相关的临床症状中起着至关重要的作用，阻断细胞因子是IBD临床常用的标准治疗方法。
DDR1是受体酪氨酸激酶，被各种类型的三螺旋胶原蛋白激活。越来越多的研究表明，DDR1与肿瘤、动脉粥样硬化、器官坏死和炎症性疾病有明显的关系。DDR1不仅能诱导炎性细胞因子的分泌，更重要的是通过其他刺激物，如促炎性细胞因子或细菌产物来扩大其影响。研究员们已发现了几种具有不同选择性的DDR1抑制剂，并证明了它们在各种体内模型的治疗潜力。然而，这些抑制剂仍具有较差的靶点特异性，而且DDR1在IBD模型中的药物抑制效果的研究较少。在本研究中，作者构建了一个基于支架（scaffold）的分子设计工作流程，基于深度生成支架装饰模型设计DDR1抑制剂，并成功鉴定了一种在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中具有体内疗效的先导化合物。
基于scaffold的分子设计工作流程包括三个步骤（图1）：（i）利用Arús-Pous等人提出的匹配分子对（MMP）算法获得包含大量官能团组合的片段库，使用片段库和随机SMILES作为训练集来训练生成模型，生成模型学习有关骨架和片段如何连接或装饰的特定信息。（ii）将DDR1的骨架输入训练好的生成模型中，生成模型依次为骨架中的每个附着点生成装饰器，直至完成所有附着点修饰，最后得到基于骨架的虚拟分子库。(iii)对生成的分子库进行激酶活性虚拟分析和分子对接筛选，寻找潜在的先导化合物。
通过基于机器学习的活性评分和虚拟筛选，确定了一系列新的吡唑并[3,4-d]哒嗪酮衍生物FGFR抑制剂。根据化合物DC-1的激酶选择性谱，发现DC-1对DDR1表现出较弱的交叉活性，在0.1μM时抑制率为48%。然后利用分子对接技术分析了DC-1在FGFR1和DDR1配体结合口袋中的结合模式。比较DDR1与FGFR1的结合口袋(图2A)，可以发现DDR1的结合口袋在DC-1的苯基区有更大的扩展空间。如图2B所示，DC-1的哒嗪部分与DDR1铰链区的残基Asp702和Met704形成三个氢键，DC-1与DDR1晶体结构（PDB ID 5FDP）中的配体更好地重叠。DC-1的N-苯基取代基到达DDR1环路部分的溶剂暴露区，表明N-苯基可以进一步修饰。DC-1的优化策略分为两部分：（1）展开苯并呋喃环填充疏水口袋；（2）修饰DC-1的苯基（图2B）。这些结果表明DC-1有很大的潜力被修改为有效的DDR1抑制剂。
图2. （A）DC-1与FGFR1（蓝色）和DDR1（灰色）结合口袋的比较。（B）DC-1的对接构象（绿色）叠加到5FDP配体（黄色）与DDR1的共晶体结构中。氢键用黄色虚线表示；关键残基用橙色表示。
作者提出了一个基于骨架的分子设计工作流程，通过深度生成模型来寻找官能团的最佳组合。模型结构如图3A所示，作者使用基于注意力机制的编码器-解码器结构来为骨架中的每个附着点生成合适的装饰。该编码器由双向递归神经网络(BiRNN)组成，对输入向量进行处理，然后将得到的两个方向的隐藏状态汇总到解码器中。解码器是一个单一方向的RNN，它被训练用来预测下一个装饰标记。利用全局注意机制对BiRNN隐藏层的信息输出分配不同的权重。该模型将每一步编码器输出状态和隐藏状态两个方向的求和输出与当前时间内解码器的输出结合起来。最后，利用softmax函数对处理后的信息进行分类，得到每个标记的概率。生成示例如图3B所示，生成模型一次装饰一个附着点。首先，该模型装饰SMILES中的第一个附着点，然后将生成的半构建的分子作为新的骨架反馈到装饰器模型中。反复迭代该过程，直到最后一个附着点被装饰。
图3. (A) 生成模型的结构，(B) DDR1的支架装饰过程示例
利用MMP算法对902个DDR/FGFR抑制剂进行切片，得到36.03亿个分子对作为训练集。为了可视化生成的分子的相对化学空间分布，作者进行了t-分布的随机邻域嵌入(t-SNE)投影，将高维数据转换为二维表示。图4A显示了生成的分子和9种已发表的选择性DDR抑制剂的t-SNE结构多样性分布图。显然，生成的分子具有更多样化的化学空间。通过分析相应的Bemis−Murcko骨架，进一步评估生成的分子的多样性，发现总共19905个分子中有6434个Bemis−Murcko支架。这一分析也证实了生成模型的有效性，可产生一个具有不同分子的共有骨架库。
图4.(A)基于t-SNE的多维尺度化学空间分析。彩色的点代表生成的分子（浅蓝色）和已发表的选择性DDR抑制剂。(B)优先级选择合成分子的管道
考虑分子的合成和生物学研究的优先级，作者开发了一个分子分流管道（图4B）。首先，使用"泛检测干扰化合物"规则，筛选出明显杂乱的化合物。然后，使用以下分子描述符阈值对剩余的19905个化合物进行进一步筛选：-2 < logP < 7; 250 < MW < 700; HBA < 10, HBD < 5, TPSA < 150, and NRB < 10。激酶的选择性是设计先导化合物的一个重要特性，在这项研究中，作者关注的是生成的分子与各种激酶的交叉反应性，包括FGFR和那些与DDR1抑制剂有交叉反应性的激酶。
进行分子对接以获得潜在的先导候选者的列表。1648个化合物通过XP模式下的Glide模式连接到人类DDR1(PDB5FDP)晶体结构的配体位点。为了可视化结构相似度和对接分数之间的关系，绘制了树图(TMAPs)，创建一个最小生成树的二维图，根据相似度聚集分子。图5B显示了1648个分子的TMAPs，其中分子和相似值相近的分子及其邻居分别用树的点和末端分支表示。每个分子的对接分数用圆点的亮度表示，颜色越深表示对接分数越低，即可能具有更高的结合亲和力。结果表明，对接得分范围为−3~−15，随着分子结构特征的变化而显著变化，由于分子结构的相似性，子树的对接得分趋于一致。此外，作者还放大了TMAPs，用于说明前10个分子及其化学结构。结果表明，高评分分子主要集中在两个区域，其中一些结构非常相似，并归属于同一子树。
图5. (A) KinomeX预测的分子对的活性概率的箱线图。(B)剩余生成分子的TMAPs和前10个分子的放大版。
作者选择前2个化合物进行进一步的合成和生物活性实验。化合物合成如方案1所示，作者开发了一种有效的途径来获得衍生物1和2。
化合物1和2对DDR1表现出强大的抑制活性，IC50分别为10.2±1.2 nM和10.6±1.9 nM。化合物2以Asp-Phe-Gly（DFG）-Asp-out构象与DDR1结合，具有II型抑制机制（图6）。在铰链结合区与Met704和Asp702形成了两个氢键，在c-Helix中的linker amide和Glu672以及DFG motif中的Asp784之间形成了另外两个氢键。
作者评估化合物2在100nM波长下对430种激酶的选择性。如图7所示，抑制率大于50%的激酶被标记为红色圆圈，圆圈的大小与抑制率相一致。结果表明，化合物2比其他测试的激酶显示出更好的DDR1选择性。
图7. 用KinMap绘制的化合物2的激酶选择性图
化合物2抑制细胞中促炎症细胞因子的表达和DDR1的自磷化
鉴于DDR1在炎症反应中的关键功能，作者通过测量其抑制LPS诱导的促炎症细胞因子（包括IL-6、IL-1β和TNF）表达的能力来确定化合物1和2的潜在抗炎效果。结果显示，化合物2在10μM时可明显抑制小鼠初级骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）和人类THP-1衍生巨噬细胞中LPS诱导的这些促炎症细胞因子的表达（图8A,C），并优于化合物1的效力。此外，化合物2显示出对LPS诱导的IL-6表达的剂量依赖性抑制（图8B，D）。为了研究化合物2是否能抑制细胞中DDR1激酶的活性，作者测量了它在THP-1细胞中阻断胶原蛋白诱导的DDR1自磷酸化的能力。如图8E,F所示，化合物2抑制基础DDR1自磷酸化的EC50为34.4 nM，这比阳性对照DDR1-IN-1的EC50为114.5 nM更有效。
图8. 化合物2抑制细胞中促炎症细胞因子的表达和DDR1的自磷化
在DSS诱导的IBD小鼠模型中进一步研究了化合物2的治疗潜力（图9）。在DSS诱导的结肠炎期间，以5或10毫克/千克的剂量口服化合物2，每天一次。在化合物2治疗的小鼠中，从DSS给药后的第5天到第8天，体重减轻明显（图9A）；在化合物2治疗的小鼠中，粪便隐血分数减少（图9B）。DSS治疗导致小鼠结肠长度明显减少，而化合物2治疗则明显改善了结肠长度（图9C,D）。组织学评估显示，模型小鼠在第9天的结肠切片中存在炎症细胞浸润、严重的上皮细胞破坏和隐窝脱落，而在化合物2治疗的模型小鼠中，这些特征得到了改善（图9E），急性结肠炎的组织学评分明显降低（图9F）。相应地，在模型小鼠中，结肠切片中IL-6、IL-1β和TNF的表达明显增加，但在化合物2治疗的模型小鼠中却低得多（图9G）。同样，模型小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF的浓度增加，但在化合物2治疗的模型小鼠中也大大降低（图9H）。综上所述，这些结果表明，化合物2在体内对DSS诱发的IBD有明显的治疗作用。
本工作中，作者构建了一个基于骨架的分子设计工作流程，以开发潜在的靶向DDR1的候选药物。作者对生成的分子进行了分子对接和激酶虚拟分析，以评估其活性和选择性，形成了一个高质量的基于骨架的分子库。作者筛选并合成了两个对DDR1表现出强大的抑制活性的化合物，其中化合物2抑制了细胞中促炎症细胞因子的表达和DDR1的自动磷酸化，且显示出更好的激酶选择性。在多种实验中化合物2都表现出了优越的性能，表明化合物2是迄今为止最具选择性的DDR1抑制剂之一。
Tan, X., Li, C., Yang, R., Zhao, S., Li, F., Li, X., Chen, L., Wan, X., Liu, X., Yang, T. and Tong, X., 2021. Discovery of pyrazolo [3, 4-d] pyridazinone derivatives as selective DDR1 inhibitors via deep learning based design, synthesis, and biological evaluation. Journal of medicinal chemistry.
