——背景——
现有的基于蛋白结构的深度学习序列设计方法，虽然在测试的计算指标上取得了很好的成果，但是还鲜有方法经过实验的考验仍然超越传统的能量函数方法。基于这一挑战，中国科学技术大学的刘海燕教授课题组，发展了名为ABACUS-R方法，相关工作名为Rotamer-free protein sequence design based on deep learning and self-consistency，于近期发表在Nature Computational Science上。
图1. ABACUS-R方法的示意图
——方法——
ABACUS-R方法包含两部分：（1）一个encoder-decoder网络被预训练用以推断给定骨架的局部环境时中心残基的侧链类型 （2）用该encoder-decoder网络连续更新每个残基的类型，最终收敛获得自洽（self-consistent）。网络的输入是中心残基与空间上最邻近（Cα间距离）k个残基组成的局部结构。邻近残基的特征包含空间层面的相对位置与取向信息（XSPA）、序列层面的相对位置信息（XRSP）以及邻近残基的残基类型（XAA）。第i个中心残基的特征包含全零的XSPA、被mask的XAA以及骨架上的15个ϕi−2, ψi−2, ωi−2 ⋯ ϕi+2, ψi+2, ωi+2，这些特征组合起来会被映射到与邻近残基特征相同的维度。以上模型输入的信息都是旋转平移不变的。局部结构中的所有残基的特征经过可学习的映射后融合后，得到每个残基总特征En。{En; n = 0, 1, 2, ... , k}经过基于
transformer架构的encoder-decoder，预测每个中心残基的类型以及其他辅助任务。
自洽迭代设计的方法是：对序列随机初始化，第一轮随机选择80%的残基通过encoder-decoder并行预测其残基类型，以后每轮随机选择的残基数目逐渐下降。最终的设计结果会逐渐收敛。
作者将PDB中的非冗余结构按照两种不同的方式划分了95%作为训练集、5%作为测试集，第一种划分方式确保测试集的结构不会存在训练集中出现过的CATH拓扑，训练得到的模型为Modeleval;第二种划分方式时随机划分Modelfinal。Modeleval可以用来评估模型能力的无偏向性的表现，而Modelfinal使用了更丰富的数据训练表现应当更好。
——表现评估——
Encoder-decoder的架构可以进行多任务学习，除了训练序列的恢复的任务以外，还可以预测二级结构、SASA、B-factor与侧链扭转角χ1、χ2。多个任务可以增强模型设计序列的能力（图2a），Modeleval与Modelfinal都可以在测试集上最好取得50%左右准确度。在测试集上的结果显示，虽然有些残基类型没有恢复正确，但是模型也学习到了替换为性质相似的残基（图2b）。
图2. Modeleval在不同任务类型下的表现
Decoder网络输出的是每个位置上残基类型的-logP，类似于选择不同残基对应的能量，所以作者将ProTherm数据集中蛋白突变的ΔΔG与模型计算出相应的−ΔΔlogits进行了比较，发现二者有一定的相关性（图2d），说明模型一定程度上学习到了能量。
接着，作者验证了模型的自洽性，测试集中100个蛋白属于CATH的三个大类，对其中的每个蛋白从随机序列出发设计10条序列，随着迭代的次数变多，平均-logP会趋于收敛（图3a），同时未收敛的残基比例也会收敛（图3b）。不同CATH类别的骨架上取得的序列恢复率差距不大（图3c）。同一蛋白骨架设计出的序列会有很高的相似性（0.76-0.89）。设计出的序列与天然序列相比，序列的成分高度相似（图3d），Pearson相关系数达到了0.93，但GLU、ALA与LYS出现得更频繁，而Gln、His、Met出现得更少。此外，ABACUS-R设计出的序列与ABACUS设计出的序列相比，平均每个残基的Rosetta打分更低（图3e），而平均的-logP打分却更高（图3f），这意味着ABACUS-R学习到的能量与Rosetta打分函数存在正交的部分。
图3. ABACUS-R的自洽能力、设计能力以及学习到的能量与Rosetta打分的比较
相较于其他深度学习方法在单个残基恢复任务上的表现，ABACUS-R超过了除DenseCPD外的所有方法（表1），在整条序列重设计任务上ABACUS-R在两个测试集上都取得了最好的表现（表2）。
表1. ABACUS-R相较其他深度学习方法在单个残基恢复任务上的表现
表2. ABACUS-R相较其他深度学习方法在整条序列重设计任务上的表现
最后，作者在3种天然骨架（PDB ID: 1r26, 1cy5 and 1ubq）上通过实验验证了ABACUS-R的设计能力。设计的方法有两种：第一种采用迭代自洽的设计方法（生成序列的多样性低），第二种采用迭代时对decoder输出结果进行采样（生成序列的多样性高，但-logP能量也略高）。
第一种方法设计的27条序列有26条成功表达，体积排阻色谱与1H NMR实验结果显示所有的蛋白都以单体形式存在，示差扫描量热实验显示5条序列有很好的热稳定性（ 97~117 ∘C ）。最终，1r26的3个设计与1cy5的1个设计成功解出了晶体结构，Cα RMSD位于0.51~0.88 Å，而1ubq的1个设计虽然没有解出结构，但已有的实验结果显示它折叠成了明确的三维结构。
第二种方法对同一骨架设计的序列相似度在58%左右。30条设计的序列中，25条被成功表达，23条能被可溶地纯化。所有设计同样都是单体存在并且折叠成了明确的三维结构，5个设计有很好的热稳定性（85~118 ∘C）。最终，1r26的1个设计被成功解出了晶体结构，Cα RMSD为0.67 Å。相较方法一的自洽设计，方法二设计成功率下降，成功设计的蛋白热稳定性也略微下降，但作者认为可以接受。
最后，作者展示了所有1r26设计晶体结构核心的侧链pack（图4a,b），以及
1cy5设计晶体结构的侧链的极性作用（图4c），说明了ABACUS-R学会了设计侧链的组合以pack好的结构。
图4. 晶体结构侧链的细节
——总结——
总之，作者开发的ABACUS-R方法在不需要显示地模拟侧链，可以学习到给定结构下侧链类型的能量打分。ABACUS-R不仅取得了很好的序列恢复度，还在实验上取得了很好的成功率。
参考文献：
Liu, Y., et al., Rotamer-free protein sequence design based on deep learning and self-consistency.Nature Computational Science 2022.
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