Digital Western技术助力IRAKs PROTAC药物研发

Digital Western技术已全面助力白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs)蛋白研究。IRAKs蛋白家族由IRAK1、IRAK2、IRAK3（IRAK-M）和IRAK4四种同工酶组成，介导白细胞介素1受体（IL-1R）和Toll样受体（TLR）信号通路。活化的TLR/IL1R导致Myddosome组装，这是一种由MyD88、IRAK4和IRAK2组成的多蛋白复合物，它通过IRAK4依赖性磷酸化激活丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK1。IRAK1与E3泛素连接酶TRAF6结合，后者介导IKK复合物的激活，导致NF-κB靶基因的转录。IRAK1/TRAF6 复合物还可以通过组装具有催化活性的TAB2-TAB3-TAB1复合物来激活JNK和p38信号传导。在单核细胞和巨噬细胞中，IRAK3通过抑制IRAK4和IRAK1的激活负向调节IRAK信号传导。

IRAK1和IRAK4是组织中广泛表达的经典激酶，而IRAK3是一种假激酶，只在骨髓细胞系中表达，缺乏激酶活性。迄今为止，没有传统小分子抑制剂靶向IRAK3，2020年，Degorce等报道了第一个选择性降解IRAK3靶点的PROTAC分子，但相关研究没有揭示降解后功能变化。IRAK3作为TLR通路的负调控因子，可能会降低先天免疫反应。在肿瘤微环境中，敲除IRAK3显示骨髓细胞功能增强以促进抗肿瘤响应。与肿瘤细胞共培养的单核细胞显示TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表达降低，但IRAK3表达增加。相反，与野生型 (WT) 树突状细胞（DCs）相比，IRAK3-/-小鼠树突状细胞的促炎细胞因子表达增加，从而诱导T细胞反应并导致肿瘤生长抑制，降解IRAK3可能成为免疫肿瘤治疗中一个有吸引力新策略。IL-12是由活化的树突状细胞和巨噬细胞产出的主要促炎细胞因子，通过诱导促IFN-γ细胞因子，在促进Th1介导的抗肿瘤反应、T细胞活化和增殖中发挥重要作用。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和PROTAC选择性降解IRAK3来研究后续DCs中功能和表型变化。根据下图在人单核细胞衍生的树突状细胞中基因编辑敲除IRAK3基因，采用基于毛细管电泳技术Digital Western（也称为Simple Western）验证基因敲除效率，2个供体显示完全敲除，另一个显示保留10% IRAK3蛋白表达，结果显示通过CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表达水平。敲除了IRAK3后，在脂多糖（LPS）刺激后，通过检测细胞上清液中细胞因子分泌水平，结果显示IL-12p40分泌显著增加，与对照相比，浓度增加了1.5到2倍。同时IL-12p70分泌也具有增长趋势，但IL-10没有影响。

通过系列体外实验，筛选到一个选择性降解IRAK3的PROTAC苗头化合物，D-1。无论有无LPS刺激时，采用D-1处理原代人DCs都可实现浓度依赖性IRAK3选择性降解，24h实现最大降解活性。进一步检测分泌细胞因子浓度水平变化，在100 ng/mL LPS刺激时，IL-12p40细胞因子浓度随着降解剂浓度依赖性增加。

采用PROTAC D-1和LPS处理的DCs中IL-12p40浓度增加与CRISPR/Cas9 KO实验结果一致的，证明了两种方法有效性，证明通过PROTAC蛋白降解剂对IRAK3靶点可成药性。通过深入了解研究IRAK3生物学，扩大了PROTAC分子降解靶点库，并支持了潜在治疗靶点的基因编辑缺失和化学降解之间的相关性。

AbbVie公司的该项研究主要利用全自动毛细管Digital Western技术检测IRAK3靶蛋白表达水平，探究CRISPR/Cas9基因编辑技术和PROTAC蛋白降解技术处理后细胞蛋白表达，准确定量靶向蛋白降解研究过程量效关系。再次证明了Digital Western 可快速地、可重复性精准定量内源性蛋白质表达，是PROTAC技术平台构建的必备技术。

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 注册商标，其他商标和注册商标是其各自所有者的财产。