英文原题：Machine-Learning-Assisted Procoagulant Extracellular Vesicle Barcode Assay toward High-Performance Evaluation of Thrombosis-Induced Death Risk in Cancer Patients
通讯作者：王树涛、孟靖昕，中国科学院理化技术研究所；张澍田，首都医科大学附属北京友谊医院
作者：闵力、包寒、凡钦、郭庆东、刘明远、朱圣韬
静脉血栓栓塞症（VTE）是癌症患者最致命的并发症，造成了约9%的癌症相关死亡。由于临床上缺乏准确和有效的VTE风险评估方法，VTE的漏诊可能导致延迟的医疗干预，甚至患者的死亡。大量研究表明细胞外泌体（EVs）通过其表面携带的组织因子，启动外源性凝血反应，导致血液的高凝状态甚至促进了VTE的形成。目前亦有部分研究探索了血浆EVs的促凝能力，但并未开发出针对具体临床应用的检测技术。
近期，中国科学院理化技术研究所王树涛、孟靖昕研究员团队和首都医科大学附属北京友谊医院张澍田教授在ACS Nano上报道了一种血浆EVs凝血能力的检测芯片（PEVB），并用于癌症患者血栓风险的精准预测。
图1. 用于VTE风险精确预测的PEVB检测的设计示意图。
为了准确评估癌症患者血浆中促凝EVs提高的VTE风险，并防止模棱两可的诊断，研究者开发了一种基于TiO2纳米花（TiNFs）的PEVB检测方法。PEVB检测方法实现了三个关键要素：（ⅰ）基于TiNFs的快速EVs捕获；（ⅱ）易操作的原位EVs促凝能力测试，通过计数阳性条带数量获得条带分数；（ⅲ）机器学习辅助的临床数据分析以进行准确的VTE风险评估。仅需简单地将血浆样品滴在TiNFs上便可以进行无修饰的快速EVs捕获。随后，通过可视化的EVs介导凝血反应来原位地测试EVs促凝能力。EVs上的凝血相关组分使得血液凝固获得红色的阳性条带数量（条带分数）。条带分数可以初步但直观地指示VTE风险。为了显著提高检测准确性和特异性，采用机器学习将条带分数与D-dimer筛查和其它常规临床信息整合，从而高效区分VTE患者。并将VTE风险可视化，以便更快、更简便的评估VTE风险（图1）。
图2. （a）分子识别与拓扑匹配高效分离EVs，标尺，200 nm。（b）EVs分离能力，大约20分钟后达到平台期。（c, d）不同TiNFs对PBS和血浆中EVs的捕获能力。TiNFs最多的结构展现了最高的捕获能力。（e）不同方法对EVs的分离能力。（f）不同方法对EV RNA的分离能力，LTiNFs表现出与黄金标准超速离心相当的捕获能力，能够为后续测试富集足够的EVs。（g）通过不同方法获得的EVs成分的免疫印迹（WB）检测，显示蛋白组分的一致性。
研究表明，通过TiO2-磷脂化学键合和拓扑识别协同作用，EVs能够被高效捕获在TiNFs上（图2a）。随后，作者确定了EVs的最佳分离时间（图2b）。研究发现，三种不同覆盖率的TiNFs中，具有更多纳米结构的LTiNFs能获得更高的分离效率（图2c和2d）。与两种常见的EVs分离方法超速离心法（UC）和尺寸排除层析法（SEC）相比，LTiNFs能够获得与金标准UC技术相当的EVs（图2e和2f），同时保留EVs的各类蛋白用于后续分析（图2g）。该方法将分离时间缩短到30分钟，而传统的两种方法需要长达6小时。
研究者进一步测试EVs的促凝效果，设计了基于梯度浓度凝血酶的体外凝血反应体系。研究发现，随着EVs浓度的增加，促凝能力增强，表明能够根据芯片上是否触发凝血反应评估EVs的促凝能力。
图3. （a）PEVB芯片图，标尺，10 mm。（b，c）条带位置和间隔位置的SEM图片，标尺，500 nm。插图为对应位置接触角数据。（d）PEVB检测流程，先在每个条带上滴加血浆完成EVs分离后，滴加凝血指示剂获取阳性条带分数。（e）针对不同癌症的阳性条带分数典型结果图。（f）针对不同癌症的阳性条带分数统计图，不同癌症条带分数具有显著性差异。（g）癌症患者同非癌人群条带分数统计图，癌症患者同非癌患者条带分数具有显著性差异。（h）VTE患者同非VTE患者条带分数统计图，VTE患者同非VTE患者条带分数具有显著性差异。
研究者将基于光刻的表面亲疏水图案化处理技术和TiNFs生长技术相结合，集成多个凝血反应，成功制备了PEVB。其表面白色条带位置为亲水的TiNFs，透明间隔位置为疏水的无结构区域，以避免相邻条带的影响（图3a，3b和3c）。研究者使用这种PEVB对来自8种癌症的167名患者进行EVs促凝能力（条带分数）的评估。研究发现，不同癌症患者的血浆EVs促凝能力（条带分数）不同，但整体显著高于健康人群（图3f和3g）；而患有VTE的癌症患者的血浆EVs促凝能力也显著高于没有VTE的癌症患者（图3h）。
最后研究者将PEVB结果同常用临床信息结合起来，通过筛选合适的机器学习模型，最终实现了0.993的AUC水平，检测特异性97.1%，敏感性96.8%，准确性97.0%，显著优于目前临床上使用的其他VTE风险预测工具（例如D-dimer检测，特异性44.8%，灵敏度90.3%，准确率53.2%）。此外，研究者还实现了可视化VTE预测模型的构建。
本文构建了一个快速、可视化的VTE检测平台，从而准确评估癌症患者的VTE风险概率。该检测平台操作简便，成本低廉，检测高效，能够实时为医护人员提供准确的VTE风险数据。因其良好的性能，我们相信这种检测方法可以很容易地应用于临床实践，作为一种非侵入性、方便、常规、高特异性和先发制人的方法来精准评估VTE风险。
相关论文发表在ACS Nano，首都医科大学附属北京友谊医院闵力副教授和中国科学院理化技术研究所包寒博士为第一作者，中国科学院理化技术研究所王树涛、孟靖昕研究员和首都医科大学附属北京友谊医院张澍田教授为通讯作者。
首都医科大学附属北京友谊医院主任医师、教授、博士生导师，在国际上首次提出“消化内镜学(Endoscopology)”。先后主持国家重点研发计划、国家重大科研仪器研制等项目。以通讯或第一作者在Gut, Endoscopy, Am. J. Gastroenterol.等杂志发表SCI论文100余篇。兼任中国医院协会第三、四届副会长，中华医学会消化内镜学分会第七届主任委员，中华医学会消化病学分会第九届副主任委员，北京医学会消化内镜学分会第六届主任委员。
中国科学院理化技术研究所研究员。入选2023年北京市杰青，担任中国化学会高级会员，中科院青年创新促进会会员，国际仿生工程学会青年委员，研究方向：从事仿生抗粘附界面材料及其在抗垢防污以及癌症诊断应用研究。发表SCI论文80余篇，其中第一或通讯作者40余篇，其中包括Nat. Protoc., Adv. Mater. 等。受邀担任《Biomimetics》编委，《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》副主编，《Nano Materials Science》等期刊青年编委。
中国科学院理化技术研究所研究员，博士生导师。入选2014年基金委国家杰出青年基金，2016年教育部长江学者岗位特聘教授，2014年国家“万人计划”青年拔尖人才，2016年中青年科技创新领军人才，2017年万人计划科技创新领军人才等。研究方向：仿生多尺度粘附可控界面材料。接受发表SCI论文200余篇，其中包括Nature, Nat. Mater., Sci. Adv., Adv. Mater., Angew. Chem., J. Am. Chem. Soc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 引用17000余次。
ACS Nano 2023, ASAP
Publication Date: October 4, 2023
https://doi.org/10.1021/acsnano.3c04615
Copyright © 2023 American Chemical Society
