4+铁死亡+机器学习+分型+实验验证，不犯迷糊，参考学习！！

‍

导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Integrated Analysis and Validation of Ferroptosis-Related Genes Associated with Ischemia/Reperfusion Injury in Lung Transplantation”，这篇文章发表在J Inflamm Res期刊上，影响因子为4.2。

结果：

移植肺再灌注前后FRG的变化

通过分析GSE 145989数据集，鉴定出483个DEG，其中包括423个上调基因和60个下调基因（图1a）。DEG与铁中毒相关基因的交叉产生了24个共享基因，称为FRG（图1b）。热图说明了在肺移植再灌注之前和之后样品中这些FRG的表达，揭示了再灌注之后所有FRG的上调（图1c）。这些FRG分为四类：驱动因子、标志物、抑制剂和未分类，包括11个驱动因子、1个标志物、9个抑制剂和7个未分类（图1d）。一些联邦德国集团属于多个类别。

FRG的功能富集分析

为了研究FRG的生物学功能，作者进行了GO和KEGG分析。在GO富集分析中，前十个富集的生物过程（BP）包括细胞对化学应激的响应、细胞因子产生的正调节、对脂多糖的响应等（图2a）。关于细胞组分（CC）和分子功能（MF），FRG主要与细胞因子活性、细胞因子受体结合和分子螯合活性相关（图2a）。此外，这些FRG富含KEGG途径，如IL-17信号传导途径和TNF信号传导途径（图2b）。

Wgcna

在GSE 145989数据集中，WGCNA将软阈值功率4确定为最佳（图3a）。通过分析共鉴定了9个模块，其中绿松石模块由6671个基因组成，并表现出与肺移植再灌注损伤的强相关性（图3b）。此外，散点图证明了绿松石模块的模块成员资格与再灌注后肺损伤的基因显著性之间的正相关性（cor=0.813）（图3c）。因此，绿松石模块被认为是后续分析的关键模块。

随后，维恩图描绘了FRG和关键模块之间的19个共享基因（图3d）。

基于LASSO回归和SVM-RFE的关键基因识别

另外，使用LASSO逻辑回归（图4a和B）和SVM-RFE算法（图4c）对19个基因进行进一步分析以鉴定关键基因。LASSO共鉴定出9个基因（TNFAIP 3、KRAS、CXCL 2、ZFP 36 L2、NEDD 4L、SESN 2、DDIT 3、SLC 7A 5、EZH 2），SVM-RFE共鉴定出11个基因（TNFAIP 3、KRAS、CXCL 2、GCH 1、SLC 2A 3、MT 1G、KDM 6 B、CDKN 1A、SESN 2、NEDD 4L、IL 6）。最终，选择TNFAIP 3、KRAS、CXCL 2、NEDD 4L和SESN 2作为与再灌注相关的关键基因（图4d）。

验证数据集中关键基因的表达验证和ROC曲线

为了进一步确定关键基因作为肺移植缺血/再灌注损伤的诊断生物标志物的准确性，使用GSE 18995数据集进行验证。结果表明，验证数据集中所有关键基因的表达在再灌注后均增加（p<0.05，图5a-e），ROC曲线AUC值均大于0.7（图5 f），表明这五个关键基因可作为肺移植缺血/再灌注损伤的生物标志物。此外，在GSE 18995数据集中，作者对心源性死亡（DCD）和脑死亡（DBD）后捐赠样本进行了亚组分析。结果显示，关键基因的表达模式在DCD和DBD亚组中以及当所有样品组合时是一致的（数据未显示）。这些结果表明，DCD和DBD样本之间的异质性对有关铁死亡关键基因的最终结论的影响极小。这进一步支持了这些关键基因作为肺移植缺血/再灌注损伤生物标志物的可靠性。

肺缺血/再灌注损伤小鼠模型中关键基因的验证和LIRI中铁死亡相关候选基因的鉴定。

为了确定在再灌注期间抑制铁死亡是否可以减轻肺缺血/再灌注损伤，作者在再灌注开始时向小鼠腹腔内给予Fer-1，一种铁死亡抑制剂。HE染色显示I/R加重了肺损伤，其特征为中性粒细胞浸润、肺泡隔增厚、透明膜形成以及肺泡腔内存在蛋白质碎片。然而，如图6a所示，Fer-1改善了这些形态学异常。铁代谢紊乱和脂质过氧化是铁缺乏症的重要特征。如图6 b所示，小鼠肺组织中的铁和MDA水平在肺I/R后显著升高，但在Fer-1治疗后降低。相反，GSH，发挥抗氧化作用，显着增加后Fer-1的应用。虽然GPX 4的mRNA表达在三组之间没有显示出统计学差异，但Fer-1处理有增加表达的趋势。此外，环加氧酶2（COX 2）的mRNA表达在I/R后升高，并且在Fer-1应用后降低（图6c）。这些发现表明，铁死亡发生在小鼠肺I/R，并在再灌注早期干预Fer-1抑制铁死亡，从而减弱LIRI。使用RT-qPCR在有或没有肺缺血/再灌注损伤的小鼠中进一步验证了五个铁中毒相关关键基因的表达。在具有肺缺血/再灌注损伤的小鼠中，与正常肺组织相比，TNFAIP 3、CXCL 2、NEDD 4L和SESN 2的水平显著升高，但在Fer-1治疗后降低。然而，KRAS的mRNA水平不随Fer-1的应用而降低（图6d）。因此，TNFAIP 3、CXCL 2、NEDD 4L和SESN 2被选为与肺缺血/再灌注损伤中的铁死亡相关的候选基因。

LIRI预测模型及诺模图的构建

接下来，作者使用四个候选基因（TNFAIP 3、CXCL 2、NEDD 4L和SESN 2）构建逻辑回归模型。模型的AUC为0.9891（95%CI 0.9728-1.0000）（图7a），其高于四种基因的个体AUC（TNFAIP 3、CXCL 2、NEDD 4L和SESN 2的AUC分别为0.9746、0.9327、0.8937和0.8888），表明模型对LIRI具有更好的诊断能力。作者还在GSE 18995数据集中验证了该模型，其中AUC为0.95（图7a），其也高于四个基因的个体AUC，进一步证实了该模型的稳健性。此外，作者使用列线图来可视化疾病发生的风险。诺模图中的每个变量都向上投影到一个点，四个变量的总分转换为个人的疾病风险。总评分越高，发生LIRI的风险越高（图7 b）。校准曲线显示实际和预测观察结果之间无明显偏倚（图7 c）。作者使用决策曲线分析（DCA）验证诺模图的临床效用。如图7 d所示，DCA在0-1的阈值概率范围内表现出更高的总体净效益。

免疫细胞浸润

使用CIBERSORT算法，作者确定了肺移植再灌注前后GSE 145989数据集中22种免疫细胞类型的比例（图8a）。与再灌注前相比，再灌注后免疫细胞发生显著变化，包括中性粒细胞、活化的树突状细胞、静息的肥大细胞、活化的肥大细胞、巨噬细胞M2、静息的NK细胞、浆细胞、T细胞CD4记忆活化、T细胞CD4幼稚、T细胞γ δ和巨噬细胞M1（图8b）。随后，对免疫细胞进行相关性分析，揭示了一些免疫细胞如中性粒细胞和CD4幼稚T细胞之间的强协同作用。而中性粒细胞和巨噬细胞M2表现出强拮抗作用（图8c）。提示免疫细胞在肺缺血再灌注损伤中起重要作用。

候选基因与免疫浸润的相关性

图8d示出了四种候选基因与免疫细胞之间的显著相关性。TNFAIP 3与11种免疫细胞类型显示出显著相关性，与巨噬细胞M2观察到最显著的负相关性（r =-0.698，P < 0.001）。CXCL 2与神经元正相关（r = 0.377，P < 0.001），与巨噬细胞M2负相关最显著（r =-0.544，P < 0.001）。NEDD 4L与静息肥大细胞呈显著负相关（r =-0.503，P < 0.001），与活化肥大细胞呈显著正相关（r = 0.512，P < 0.001）。SESN 2与8种免疫细胞类型相关，与M2巨噬细胞的相关性最强（r =-0.400，P < 0.001）。作者发现了候选基因与免疫浸润之间的关系，这表明这些基因可能对免疫细胞浸润有潜在的影响，但它们是原因还是后果尚不清楚。

候选基因与PGD的孟德尔随机化分析

LIRI是肺移植后PGD的主要原因。作者利用孟德尔随机化进一步研究候选基因和PGD之间的因果关系。在四个候选基因中，CXCL 2由于缺乏合适的单核苷酸多态性（SNP）而被排除。图9a说明了每个基因对PGD的因果效应。逆方差加权（IVW）分析结果显示，SESN 2（OR=0.2070，p=2.973×10^-5）与PGD风险降低相关，而TNFAIP 3和NEDD 4L与PGD的相关性无统计学意义。Cochran's Q检验表明SESN 2的结果无异质性，MR-Egger回归分析表明SESN 2的结果无水平多效性。鉴于SESN 2在PGD中的保护作用，作者构建了SESN 2的转录因子-miRNA网络（图9 b）。该网络确定了可能影响SESN2表达的4种转录因子和21种miRNA。

两种不同类型的亚铁死亡的鉴别

LIRI是肺移植后PGD的主要原因，而铁死亡被认为是LIRI病理过程的加重。为了更好地了解LIRI的临床异质性及其潜在机制，作者基于24个FRG进行了共识聚类，以研究FRG表达与LIRI多样性之间的关系。在测试从2到9的各种亚型号之后，作者发现两个亚型表现出最好的稳定性（图10a）。考虑到一些患者在肺移植后发生PGD，而另一些患者则没有，作者认为将LIRI患者分为两个亚组更好地捕捉了这种临床变异性。因此，LIRI患者被分为两种不同的模式，第1类和第2类。T-SNE显示FRG可以区分两种铁死亡模式（图10 b）。绘制热图以说明两个亚型之间24个FRG的差异表达（图10 c）。其中，KDM6B、GCH 1、IL 6、PROK 2、MAP 3K14、SLC2A3、MT1G、PTGS 2、CDKN 1A、PANX 1、HMOX 1、IL 1B、TNFAIP 3、SLC7A5和SESN 2在聚类2中比在聚类1中更高表达，而KRAS、CXCL 2、ZFP 36、NEDD4L、DDIT 3、EPT 1、IFNG、EZH 2、EGR1在两组间差异无统计学意义。作者计算了每个样品的铁死亡分数，其中亚型2表现出比亚型1更高的铁死亡分数（图10d）。此外，使用ssGSEA来比较亚型1和亚型2之间的免疫细胞浸润的差异（图10e）。作者发现，活化的B细胞，CD56亮自然杀伤细胞，和未成熟的树突状细胞在群集1中比群集2中显著更多的浸润。效应记忆CD 4 T细胞、中性粒细胞和1型T辅助细胞在两个亚型之间没有显示出统计学显著差异，而其余19种免疫细胞类型在亚型2中比在亚型1中更多地浸润。为了阐明这些FRG有助于两个亚型的潜在机制，作者对两个亚型之间的FRG进行了GO和KEGG富集分析（图10 f）。分析表明，与炎症和免疫调节相关的功能显着丰富。其中，“参与免疫应答的细胞因子产生的调节”在生物过程类别中显著富集，并且与诸如“TNF信号通路”和“IL-17信号通路”的关键通路重叠，这表明所研究的靶标通过这些通路介导炎症应答。此外，在多个水平上验证了氧化应激相关功能。“氧化应激反应”的生物学过程显著丰富，与“氧化还原酶活性”的分子功能和“NF-κ B信号通路”的通路分析密切相关。这表明氧化应激通过特定的信号通路影响细胞内稳态。此外，强调了膜结构在信号转导中的重要性。细胞组分术语“质膜筏”和“膜微区”与分子功能“生长因子受体结合”相关，表明这些专门的膜结构充当信号传递的平台。这些发现表明，靶向这些信号通路可能会改变LIRI的亚型。需要进一步的研究来验证这些机制。

总结

作者确定了四个与肺再灌注期间铁死亡相关的候选基因：肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP 3），C-X-C基序趋化因子配体2（CXCL 2），神经前体细胞表达发育下调4-like（NEDD 4L）和sestrin 2（SESN 2）。这些基因与免疫细胞浸润密切相关。MR分析提示SESN 2可能对PGD具有保护作用。此外，共识聚类揭示了亚型之间不同的免疫浸润模式，为肺缺血/再灌注损伤（LIRI）的个性化治疗方法提供了见解。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

往期推荐

纯生信选刊

非肿瘤生信

预后模型

单基因生信

单细胞系列