今天给同学们分享一篇生信文章“Integrating Bulk and Single-Cell Transcriptomics with Machine Learning Reveals a Heme Metabolism-Based Panel for Lung Adenocarcinoma Chemotherapy Resistance ”，这篇文章发表在Int J Mol Sci 期刊上，影响因子为4.9 。
结果：
2.1. 基于血红素代谢的聚类预测 LUAD 的预后通过全面筛选分子签名数据库（MSigDB），作者鉴定出 282 个与血红素代谢相关的基因（HMGs）（ Table A1 ）。在 TCGA-LUAD 队列中，对这 282 个基因进行单变量 Cox 回归分析，发现其中 49 个基因与总生存期（OS）强相关（ Table A2 ）。作者展示了其中 10 个基因的森林图（ Figure 2 A）。进一步分析这些基因显示出不同的突变率，其中 ABCC2 的突变频率最高，其次是 SLCO1B3 和 KAT2B（ Figure 2 B）。此外，这些基因之间存在显著的 DNA 拷贝数变异（CNV），特别是 ABCC2 和 KAT2B 表现出更高的 CNV 耗竭（ Figure 2 C）。正常组织和肿瘤组织之间 HMGs 的差异表达分析进一步揭示，这些基因中的大多数在 LUAD 肿瘤组织中显著失调，突显了它们在肿瘤进展中的潜在作用（ Figure 2 D）。
基于血红素代谢的聚类预测 LUAD 的预后。(A) HMGs 的森林图：通过单变量 Cox 回归分析，确定了 49 个与总生存期显著相关的预后基因；图中仅展示了 10 个基因。HR=1.0 处的垂直虚线表示无效应的参考线；右侧的值表明风险增加，而左侧的值表明具有保护作用。每个彩色方块的 position 代表相应基因的平均 HR，而水平线表示 95%置信区间；(B) TCGA-LUAD 队列中 HMGs 的分布和突变频率；(C) LUAD 中 HMGs 的 CNV 改变频率；(D) LUAD 肿瘤和正常组织中 49 个 HMG 的差异表达。 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001; (E) TCGA-LUAD 队列的共识热图矩阵; (F) T-SNE 分析显示两种亚型之间存在显著差异; (G) Kaplan–Meier 生存分析根据聚类分类区分了 TCGA-LUAD 患者的预后。虚线表示中位生存时间，定义为生存概率为 50%的点。本研究中所有 Kaplan–Meier 图中的虚线都代表相同的定义; (H) TCGA-LUAD 队列的时间依赖性 ROC 曲线分析。 灰色的虚线代表随机分类的参考线（AUC = 0.5）。本研究中所有时间依赖性 ROC 曲线中的虚线都表示相同的意义；（I） GSE31210 队列的共识热图矩阵；（J）Kaplan–Meier 生存分析根据聚类分类区分了 GSE31210 患者的预后；以及（K）临床病理因素和基于血红素代谢的聚类单因素和多因素展示。利用这 49 种 HMGs，作者对 TCGA-LUAD 肿瘤患者进行了无监督共识聚类，以识别与血红素代谢相关的亚型。根据 CDF 和 delta 面积图，k = 2 和 k = 3 都被认为适当（ Figure A1 a,b）。虽然 k = 3 显示出可接受的聚类稳定性并显示出亚型分层的潜力（ Figure A2 ），但 k = 2 提供了更清晰的分离，并最终被选为最佳选择，将队列分为两个簇：C1（n = 253）和 C2（n = 152）（ Figure 2 E）。选择 k = 3 的理由在讨论部分详细阐述。t-SNE（t 分布随机邻域嵌入）证实了两个簇之间的清晰分离（ Figure 2 F）。Kaplan–Meier 生存分析显示，与 C1 簇的患者相比，C2 簇患者的总生存期显著更差（p < 0.0001， Figure 2 G）。这一发现进一步在 GSE31210 数据集上得到验证（ Figure 2 I,J）。 时变受试者工作特征（ROC）曲线分析进一步证实了共识聚类的预测能力，在 TCGA-LUAD 训练集中（ Figure 2 H），1、3 和 5 年的曲线下面积（AUC）分别为 0.62、0.62 和 0.68。最后，单因素和多因素 Cox 回归分析证实，聚类分组是 LUAD 的独立预后因素（ Figure 2 K）。2.2. HMRS 面板在 LUAD 风险分层中显示出强大的预后价值为构建与血红素代谢相关的预后特征面板，作者利用上述 49 个 HMGs，通过 LASSO 回归结合多变量 Cox 比例风险分析（ Figure 3 A）对面板进行优化。通过 10 折交叉验证的 100 次迭代，确定最佳 lambda 值为 3.73（ Figure 3 B）。作者发现 ABCC2、AQP3、JCHAIN 和 SLC2A1 这四个基因被持续选中（选择频率=1.00）。所有选择频率大于零的基因及其对应的回归系数显示在 Figure 3 C 中，其中绝对值越高表明该基因对模型的贡献越大。此外，使用评分指标（score=频率×贡献），作者筛选出 16 个基因（ABCC2、SLCO1B3、SLCO2B1、JCHAIN、AQP3、DMTN、EIF2AK1、FBXO9、HTATIP2、LRP10、MAP2K3、NFE2、NNT、SLC2A1、SMOX 和 TENT5C），这些基因的评分排名在前 50%，用于进一步分析（ Figure 3 D）。其中，LRP10、SLC2A1 和 ABCC2 与患者生存事件的相关性最强。 基于这些发现，作者为每位 LUAD 患者建立了血红素代谢风险评分（HMRS）作为一个面板，使用以下公式：HMRS = ABCC2 × 0.0738 + SLCO1B3 × 0.0307 + SLCO2B1 × (−0.0524) + JCHAIN × (−0.0341) + AQP3 × (−0.0289) + DMTN × (−0.0999) + EIF2AK1 × 0.0880 + FBXO9 × (−0.0941) + HTATIP2 × 0.0345 + LRP10 × 0.1718 + MAP2K3 × 0.0365 + NFE2 × (−0.0848) + NNT × (−0.0567) + SLC2A1 × 0.0764 + SMOX × 0.0530 + TENT5C × (−0.0631).
HMRS 面板在 LUAD 风险分层中显示出强大的预后价值。 (A) 对 100 次迭代中通过 LASSO 回归调整的参数选择进行十倍交叉验证，为了清晰和美观，仅显示了 49 个 HMGs 中 16 个被选为进一步分析的基因在系数路径图中的分布；(B) LASSO 分析中的系数筛选，从 100 次迭代中确定最佳 lambda 值为 3.73；(C) 基因选择频率大于零的基因的频率和回归系数；(D) 基于评分指标的基因选择，选择了排名前 50%的 16 个基因进行进一步分析；(E) Kaplan–Meier 生存分析基于 HMRS 面板区分了 TCGA-LUAD 患者的预后；(F) 基于 HMRS 面板的 TCGA-LUAD 队列时间依赖性 ROC 曲线分析；(G) 低风险和高风险组之间 HMRS、生存时间和表达模式的分布；(H) 通过混淆矩阵和 Jaccard 相似性指数评估基于聚类的分类与 HMRS 风险组分层的一致性；(I) 结合年龄、等级、性别、T 分期、总分期和 HMRS 的列线图。 ns = 无显著差异，** p < 0.01，**** p < 0.0001； (J) DCA 决策曲线。患者随后根据中位数 HMRS 值作为截止阈值被分为高风险组和低风险组。Kaplan–Meier 生存分析显示，与低风险组相比，高风险组患者的总生存期（OS）显著缩短（p < 0.0001, Figure 3 E）。在 TCGA-LUAD 训练队列中，该面板在预测 1 年、3 年和 5 年生存率时分别达到了 0.70、0.71 和 0.77 的 AUC 值（ Figure 3 F）。在两个独立的验证队列中观察到一致的性能， GSE31210 队列的 AUC 值为 0.72、0.70 和 0.78， GSE68465 队列的 AUC 值为 0.63、0.66 和 0.69（ Figure A3 a–f）。值得注意的是，该面板不仅在时间依赖性 ROC 分析中表现出稳健的预测稳定性，而且在风险分层方面优于共识聚类方法。这些发现突出了 HMRS 面板在区分 LUAD 患者预后风险方面的有效性，为精确的预后评估提供了一种可靠的定量工具。热图揭示了高风险组和低风险组之间 16 个血红素代谢风险基因的差异表达模式（ Figure 3 G）。 值得注意的是，ABCC2、SLCO1B3、SLC2A1 和 SMOX 在高风险组中的 z 分数值显著高于低风险组，这表明它们在决定不良预后中可能发挥着关键作用。
为评估共识聚类与基于 LASSO 的风险分层的一致性，作者采用了 Jaccard 相似性度量。分析结果显示，这两种分类方法具有高度相似性，高风险组与聚类 2 之间的 Jaccard 指数为 0.96，低风险组与聚类 1 之间的 Jaccard 指数为 0.85 ( Figure 3 H)。这些结果表明共识聚类与基于 LASSO 的聚类具有高度一致性，特别是在高风险预后组中，患者分布几乎完全相同。这种高度一致性表明，高风险组与聚类 2 中的患者可能具有相似的生物学特征，可能导致相似的疾病进展模式、治疗反应和临床结果。为提升血红素代谢风险评分（HMRS）面板的临床应用价值，作者构建了一个整合 HMRS 面板及其他临床特征的列线图，为 LUAD 患者提供了一种全面且直观的风险评估工具（ Figure 3 I）。比较分析表明，HMRS 面板在预测性能上优于其他临床因素。决策曲线分析（DCA）进一步证实，整合 HMRS 面板与临床特征的列线图在临床预测效用方面显著优于仅基于临床特征的模型（ Figure 3 J）。这些结果表明，HMRS 面板在评估 LUAD 患者风险方面可能具有强大的预后预测潜力。2.3. 基于 HMRS 的组别中代谢重编程和铁死亡调控是主要差异为了探索 HMGs 在高风险和低风险组中的表达特征，作者进行了比较分析（ Figure 4 A）。结果表明，在高风险组中，SLC2A1、SLC7A11、SMOX 和 ABCC2 等基因的表达水平显著升高。通过 limma R 软件进行的差异基因表达分析，通过火山图（ Figure 4 B）进行可视化，进一步突出了两组之间转录特征的差异。前 20 个差异表达最显著的基因被突出显示，强调了高风险和低风险队列之间的显著转录分化。作者观察到，高风险组中与细胞周期调控和细胞分裂相关的基因（如 GTSE1、CCNA2 和 CDC20）以及与葡萄糖代谢相关的基因（如 SLC2A1 和 GAPDH）的表达水平升高。相比之下，低风险组中与肺和气道上皮细胞功能相关的基因（如 SCGB3A2 和 SFTPB）的表达水平更高，这表明肺功能可能得到更好的保留，可能有助于降低恶性程度。 此外，低风险组中参与氧化还原代谢的基因（如 ADH1B 和 GGTLC1）的上调表明这些细胞可能进行适当的氧化还原调节，从而维持正常的细胞功能。代谢重编程和铁死亡调控是 HMRS 分组中的关键差异。(A) 49 种 HMGs 在 HMRS 分组中的表达特征；(B) 高风险组和低风险组差异基因表达分析的火山图，相应的热图显示了这些前 20 个基因在每个风险组样本中的表达模式。虚线水平线和垂直线分别表示统计显著性阈值（p < 0.05）和倍数变化（|log2FC| > 1）；(C) GSVA 热图；(D) GSEA 图。基因集来自 MsigDB 数据库中的标志性集合。垂直虚线 0 表示排序列表中的零富集得分点；(E) 差异表达基因的 GO 分析柱状图。 BP，生物过程；CC，细胞组分；MF，分子功能；（F）差异表达基因的 KEGG 分析柱状图；（G）细胞死亡机制的 GSEA 图（p < 0.05）。垂直虚线 0 表示排名基因列表中富集得分为零的点。为进一步表征这些代谢风险亚型的生物学特征，基因集变异分析（GSVA）显示高风险组（Figure 4 C）中与致癌和代谢相关的通路显著富集。关键代谢通路，包括磷酸戊糖途径、糖酵解和氨基酸代谢，被显著激活，反映了肿瘤细胞能量产生和生物合成所必需的代谢重编程。此外，驱动细胞增殖的通路——如 MYC 靶点、细胞周期、mTORC1 信号通路和 DNA 修复机制——显著上调，支持快速肿瘤生长和基因组稳定性。与蛋白质降解、unfolded protein response（UPR）和 RNA 剪接相关的通路进一步突出了高风险组对细胞应激的适应性。基因集富集分析（GSEA）进一步证实了这些发现，前五个具有最高标准化富集得分（NES）的通路为 E2F 靶点、上皮间质转化（EMT）、G2M 检查点、糖酵解和 MYC 靶点（ Figure 4 D）。 这些结果表明高风险组的特点与增殖活性增加、代谢适应和肿瘤进展潜力相关。从基因本体（GO）富集分析中，作者观察到高风险组下调的基因在脂肽结合通路中显著富集，而铁离子结合以及与细胞生长相关的通路（如染色体分离）则上调（ Figure 4 E）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析证实了与细胞增殖、代谢重编程和肿瘤进展相关的通路上调（ Figure 4 F），表明细胞分裂和 DNA 合成活性增强。值得注意的是，高风险组中铂类药物耐药通路的上调可能表明化疗耐药性增加的趋势，提示其潜在的临床相关性。相比之下，低风险组显示出与脂质代谢和细胞功能维持相关的通路显著富集。 值得注意的是，花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢等通路显著激活，这表明脂质代谢可能在这一群体中调节炎症和支持细胞稳态方面发挥潜在作用。此外，紧密连接通路富集，该通路在维持细胞屏障功能中起关键作用，可能反映了低风险群体倾向于更稳定的生理调节，从而有助于保持正常组织完整性和功能。为进一步研究高低风险群体细胞死亡机制的差异，作者对 18 种细胞死亡通路进行了 GSEA 分析。值得注意的是，高风险群体显示出铁死亡抑制通路（ Figure 4 G）的显著富集，这表明铁死亡抗性与增强肿瘤细胞存活和进展可能存在潜在关联。与作者的早期发现一致，低风险群体可能增强脂质过氧化并诱导铁死亡，这可能与肿瘤活力降低有关。这些结果共同强调了脂质代谢在影响铁死亡相关过程中的可能作用，这可能有助于解释低风险组中观察到的更有利的预后。虽然其他细胞死亡途径，如凋亡，在高风险组中也得到富集，但作者的分析集中于铁死亡，因为它在肿瘤进展和治疗潜力方面发挥着日益重要的作用。为了进一步阐明与肺腺癌预后相关的血红素代谢特征，作者利用随机生存森林（RSF）分析来识别与患者结果密切相关（ Figure 5 A）的核心血红素代谢基因。通过计算每个基因的累积平均重要性值，并选择累积比例≤0.5 的基因，作者确定了那些对模型预测能力贡献最大的基因子集（ Figure 4 B 和 Figure A4 a）。整合 RSF 和 LASSO 算法的筛选结果，作者确定了 SLC2A1、SMOX、ABCC2、SLCO1B3 和 FBXO9 作为血红素代谢风险的核心基因（ Figure 5 C）。核心血红素代谢基因验证和单细胞水平分析。(A) RSF 分析用于识别核心血红素代谢基因；(B) RSF 分析识别出对模型预测能力贡献最大的前 50%基因；(C) RSF 和 LASSO 算法筛选基因的交集 Venn 图。左侧和右侧圆圈分别代表 LASSO 和 RSF 方法筛选的基因。交集区域表示两种方法共同识别的基因；(D) DNN 模型的训练和验证性能；(E) ROC 曲线展示了模型的预测性能，AUC 值为 0.9，表明五个基因特征在区分患者为基于 HMRS 的风险组方面具有强大的预测能力。 对角虚线表示随机分类器的性能（AUC = 0.5），作为参考基线；(F) 五个核心 HMGs 的多变量 Cox 回归分析；(G) 标记基因识别的细胞类型 T-SNE 可视化；(H) 不同细胞类型中血红素代谢风险模块评分的 Violin 图；(I) 肿瘤进展过程中不同细胞类型血红素代谢风险模块评分变化的折线图；(J) 不同肿瘤分期中血红素代谢风险模块评分的 Violin 图。总体组间差异采用 Kruskal–Wallis 检验评估，而个体分期之间的配对比较采用 Wilcoxon 秩和检验进行。** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001；(K) 假时间轨迹的上皮细胞，按假时间和临床肿瘤分期着色；(L) 沿着假时间的基因表达动态广义加性模型（GAM）拟合。为验证五个血红素代谢基因的预测能力，作者开发了一个包含注意力机制的深度神经网络（DNN）分类模型。该模型使用 TCGA-LUAD 队列进行训练，以五个血红素代谢基因的表达水平为输入，HMRS 风险组为分类标签（ Figure 5 D）。在验证过程中，模型表现出稳健的性能，准确率达到 0.79，灵敏度达到 0.82，特异度达到 0.77，AUC 达到 0.90（ Figure 5 E 和 Figure A4 b,c）。这一结果进一步强调了与血红素代谢风险相关的核心基因在基于血红素代谢风险的人群分类和 LUAD 预后评估中的关键作用。多变量 Cox 回归分析表明，由这些基因构建的预测模型与患者死亡风险显著相关，突出了该模型的临床相关性和实用性（ Figure 5 F）。2.5. 单细胞水平揭示上皮细胞中血红素代谢升高驱动肿瘤进展作者使用了 GSE131907 单细胞 RNA 测序数据，并使用不同细胞类型的标记基因对其进行注释，将细胞分类为七个主要集群，包括 T/NK 细胞，即髓系细胞、上皮细胞、B 细胞、成纤维细胞、肥大细胞和内皮细胞（ Figure 5 G 和 Figure A5 a）。为了量化不同细胞类型的血红素代谢风险，作者使用了 Seurat 包中的“AddModuleScore”函数来计算所有细胞类型中血红素代谢风险五个核心基因的表达水平（ Figure 5 H）。在七个不同的细胞类型中，上皮细胞的风险评分显著高于其他类型。进一步分析根据血红素代谢评分分组的所有细胞表明，上皮细胞中具有高血红素代谢评分的细胞比例随着肿瘤进展逐渐增加（ Figure 5 I）。基于拷贝数变异谱，上皮细胞被进一步分为肿瘤和正常亚组（ Figure 5 J 和 Figure A5 b–d）。 从正常组织到 IV 期，肿瘤上皮细胞中具有高血红素代谢评分的比例呈现阶段性上升（ Figure 5 J 和 Figure A5 e），这表明血红素代谢活性与肿瘤进展之间可能存在潜在关联。为了捕捉这一过程的动态特性，作者应用广义加性模型（GAM）来检验伪时间与血红素代谢风险模块评分之间的关系（ Figure 5 L）。伪时间被用作肿瘤进展的替代指标（ Figure 5 K）。GAM 曲线（EDF = 8.47）揭示了一种复杂、非线性的模式。总体而言，血红素代谢风险模块评分随伪时间增加，但也观察到明显的局部下降。这些波动可能反映了肿瘤内异质性和上皮细胞状态的差异。2.6. HMRS 面板作为化疗敏感性预测生物标志物为探究两组风险人群对传统化疗药物的敏感性差异，作者分析了 GDSC2 数据库的数据。在 TCGA-LUAD 队列中，药物敏感性分析揭示了 HMRS 组（ Figure 6 A 和 Figure A6 a,b）之间的不同模式。与低风险组相比，高风险组患者的紫杉醇敏感性增加，而奥沙利铂的敏感性显著降低。此外，高风险组对靶向关键信号通路（如 PI3K 和 JAK/STAT 抑制剂）、细胞周期调控（如 CDK4/6 抑制剂）、DNA 损伤修复（如 PARP 抑制剂）以及恢复突变 p53 功能（如 Nutlin-3a）的药物敏感性均较低。这些发现表明高风险组可能对多种治疗药物产生耐药性，强调了治疗这些患者的挑战，并突出了基于 HMRS 面板制定个性化治疗策略的重要性。HMRS 面板作为预测化疗敏感性的生物标志物，并通过 WGCNA 识别 ABCC2 为核心基因。(A) 药物敏感性分析的柱状图揭示了基于 HMRS 的风险组之间的不同模式；(B) Kaplan–Meier 生存分析基于 HMRS 面板区分了接受铂类化疗的 TCGA-LUAD 患者的预后；(C) 接受铂类化疗的 TCGA-LUAD 患者的时间依赖性 ROC 曲线分析；(D) GSE68465 验证队列的 Kaplan–Meier 生存分析和时间依赖性 ROC 曲线分析；(E) GSE14814 验证队列的 Kaplan–Meier 生存分析和时间依赖性 ROC 曲线分析；(F) WGCNA 识别的 49 个 HMGs 的模块分配；(G) 模块–性状相关性分析。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001；(H) 橙色模块中基因的功能富集分析。基于这些观察结果，作者进一步评估了 HMRS 面板对 LUAD 患者化疗预后的预测能力。LUAD 中使用的化疗药物主要通过 DNA 损伤[ 20 ]、细胞周期紊乱[ 21 ]和拓扑异构酶抑制[ 22 ]等机制抑制肿瘤细胞增殖。这些药物通常以联合化疗方案或其他治疗（如靶向治疗[ 23 ]和免疫治疗[ 24 ]）的形式使用，以提高疗效。为了评估 HMRS 的临床相关性，作者分析了接受铂类化疗的 TCGA 队列患者。Kaplan–Meier 分析显示，HMRS 高分组患者的预后显著差于 HMRS 低分组患者（p < 0.05） ( Figure 6 B)。ROC 曲线分析表明具有强大的预测性能，1 年、3 年和 5 年的 AUC 值分别为 0.72、0.64 和 0.80 ( Figure 6 C)。在 GSE68465 队列中的验证产生了 0.90、0.73 和 0.82 的 AUC 值（ Figure 6 D），而 GSE14814 队列在相同时间点显示了 0.79、0.83 和 0.82 的 AUC 值（ Figure 6 E）。 这些结果强调了 HMRS 面板在评估化疗疗效方面的强大预测性能，进一步支持了其在指导 LUAD 患者治疗决策中的临床应用价值。2.7. WGCNA 识别的核心基因是 ABCC2
为探索 HMGs 中高度相关的基因，作者使用 TCGA-LUAD 队列进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），以识别基因模块和核心基因。最初，作者将软阈值功率设置为八，并使用来自 405 个具有分配 HMRS 样本的全基因组表达数据构建了加权基因共表达网络，包含 19,938 个基因。遵循标准的 WGCNA 流程，生成了一个基因树状图，并确定了 36 个不同的共表达模块，每个模块由不同的颜色表示（模块颜色）（ Figure A7 a,b）。这些模块反映了在不同样本中具有相似表达模式的基因群。随后，作者将 49 个 HMG 映射到预定义的模块上，以评估它们的分布。这些基因分布在 13 个模块中，反映了血红素代谢的生物学多样性和复杂的调控特征，而不是表明人为的碎片化。（ Figure 6 F）。 值得注意的是，其中四个核心基因被分配到灰色模块，该模块代表那些不与任何已定义模块共表达的基因，因此通常被排除在下行的网络分析之外，而 ABCC2 则被分配到橙色模块。随后的模块-临床特征相关性分析（包括聚类、HMRS 和 HMRS 组）表明，橙色模块与这三个临床特征（ Figure 6 G）密切相关。为进一步探究橙色模块的生物学意义，作者提取了该模块内的所有基因并进行了功能富集分析（ Figure 6 H）。结果表明，富集通路与氧化还原代谢密切相关。重要的是，GO 分析突出了与铁死亡负调控相关的通路，这与作者之前的发现一致。在基因贡献分析中，ABCC2 对橙色模块的贡献分数相对较高（0.72），表明其可能参与血红素代谢和铁死亡（ Figure A7 c）。这些发现表明，ABCC2 可能在 HMRS 面板中发挥重要作用，可能将血红素代谢与铁死亡抑制联系起来。其参与这些过程表明其可能作为治疗靶点的相关性，并支持进一步研究其在肿瘤进展和治疗耐药中的作用。2.8. ABCC2 的抑制显著促进顺铂诱导的铁死亡作者使用 TCGA 全癌症数据集（ Figure 7 A）评估了 ABCC2 在肿瘤和正常组织中的表达模式。分析显示，在多种癌症类型中，肿瘤组织和邻近正常组织之间的 ABCC2 表达存在显著差异。具体而言，在 LUAD 中，肿瘤组织中的 ABCC2 表达显著高于正常组织，这表明其可能参与 LUAD 的发病机制和进展。为进一步探索 ABCC2 的临床相关性，作者分析了其在 TCGA-LUAD 队列患者中的表达与临床结果的关系。通过根据 ABCC2 表达的四分位数将患者分为高表达组和低表达组，Kaplan–Meier 分析显示，高 ABCC2 表达患者的预后显著差于低表达患者（p < 0.05） ( Figure 7 B)。ABCC2 的抑制显著促进顺铂诱导的铁死亡。(A) TCGA 泛癌数据集中 ABCC2 在肿瘤和正常组织中的表达模式。统计显著性表示如下：ns = 无显著差异，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001；(B) 根据 ABCC2 表达水平分层绘制的 Kaplan–Meier 生存分析；(C) 使用三种独立 siRNA 验证 ABCC2 敲低效率；(D) 共聚焦显微镜图像显示顺铂耐药 A549 细胞和 ABCC2 siRNA 处理后的顺铂耐药 A549 细胞中的脂质过氧化水平。绿色荧光表示氧化脂质，红色荧光代表非氧化脂质。合并图像显示氧化和还原信号的叠加。标尺：50 µm；(E) 顺铂耐药 A549 细胞和 ABCC2 siRNA 处理后的顺铂耐药 A549 细胞的脂质过氧化流式细胞术分析。水平和垂直线表示用于定义细胞亚群的门控边界。 颜色强度反映细胞密度，红色表示密度较高，蓝色表示密度较低；(F) ABCC2 抑制增强顺铂耐药 A549 细胞中 Fe2+ 离子积累；(G) ABCC2 抑制促进顺铂耐药 A549 细胞中 MDA 含量；(H) 铁死亡正诱导剂 RSL3 促进 MDA 积累；(I) 铁死亡负抑制剂 Fer-1 降低 MDA 水平。顺铂已被证明在某些细胞类型中诱导铁死亡，这突出了铁死亡诱导作为对抗顺铂耐药性的治疗策略的潜力[25 , 26 ]。ABCC2 是一种众所周知的药物外排多药耐药蛋白，主要通过药物外排介导化疗耐药性[ 27 ]。然而，ABCC2 是否可以通过调节铁死亡来调节化疗敏感性，在肺腺癌中尚未得到探索。为了研究这一点，作者使用顺铂耐药的 A549 细胞进行了一系列实验。使用了三个靶向 ABCC2 的独立 siRNA，它们都有效地敲低了 ABCC2 的表达（ Figure 7 C）。使用 BODIPY 581/591 C11 作为脂质过氧化的传感器，共聚焦显微镜显示，50μM 顺铂处理对顺铂耐药 A549 细胞的脂质过氧化水平没有改变。相比之下，与对照组相比，ABCC2 siRNA 处理的细胞中顺铂处理引起了脂质氧化状态的显著升高（ Figure 7 D）。这一观察结果得到了流式细胞术分析（ Figure 7 E）的进一步证实，表明 ABCC2 抑制增强了顺铂诱导的脂质过氧化。 从机制上讲，ABCC2 抑制会提高细胞内脂质过氧化水平，显著增加 Fe2+ 离子积累（p < 0.01）（ Figure 7 F），并促进丙二醛（MDA）含量（p < 0.0001）（ Figure 7 G）。这些发现表明 ABCC2 通过调节铁死亡通路来调节肿瘤细胞对顺铂的敏感性，为克服肺腺癌（LUAD）的顺铂耐药性提供了新的理论基础。值得注意的是，顺铂+siABCC2 组的 MDA 水平与顺铂+RSL3 组的水平相似，表明 ABCC2 敲低诱导的脂质过氧化与铁死亡激活相当。Fer-1 处理显著降低了顺铂+siABCC2 组的 MDA 水平，使其接近顺铂+NC 组的水平，表明存在铁死亡依赖性效应。尽管 RSL3 在 NC 组和 siABCC2 组中均升高 MDA 水平，而 Fer-1 则降低，但变化在 siABCC2 组中更为明显，这支持了 ABCC2 在调节铁死亡敏感性中的作用。
