4+WGCNA+机器学习+ROC+实验验证，容易拿分的思路，轻松简单好复现！！！

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导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Combined Analysis of Human and Experimental Rat Samples Identified Biomarkers for Ischemic Stroke ”，这篇文章发表在Mol Neurobiol 期刊上，影响因子为4.3 。

结果：

差异表达基因（DEGs）和差异表达 miRNA（DEMs）的鉴定

每个数据集在预处理后获得了表达矩阵，包括背景校正和标准化。训练集包括四个 mRNA（GSE36010 、 GSE78731 、 GSE61616 和 GSE106931 ）和一个 miRNA（ GSE46266 ）的表达谱。然后，在消除批次效应后，将四个 mRNA 数据集合并。从 46 个样本（21 个 MCAO 样本与 25 个对照样本）中获得了 7684 个基因的合并表达矩阵。通过差异表达分析，共获得了 780 个 DEGs。此外，从 GSE46266 中鉴定出 56 个 DEMs。DEGs 和 DEMs 的整体分布已通过火山图（图 1 a 和 1b）进行可视化。

在 MCAO 模型大鼠脑中鉴定差异表达的 mRNA（DEGs）和 miRNA（DEMs）。a 显示 MCAO 组与对照组之间 DEGs 的火山图。bGSE46266 数据集 DEM 的火山图。在 a 和 b 中，红色点表示上调，蓝色点表示下调，灰色点表示两组间无差异表达

基因集富集分析（GSEA）

进行了 GSEA 分析，以初步了解训练集中所有 7684 个基因的主要作用。结果表明，这些基因中富集程度最高的五个生物学过程（BP）术语包括白细胞增殖、B 细胞激活、共生相互作用、突触可塑性、运动正调控和突触可塑性调控（图2 a）。此外，涉及的五个京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路包括细胞周期、造血细胞谱系、系统性红斑狼疮、细胞因子-细胞因子受体相互作用和原发性免疫缺陷（图 2 b）。前五项在脊线图中展示（图 2 c 和 2d）。这些项目与免疫炎症反应和神经可塑性相关。调整 P 值小于 0.05 且标准化富集得分（NES）绝对值大于 1 的 GSEA 结果在呈现。

基因集富集分析（GSEA）的结果。a 三个代表性生物学过程（BPs）。b 三个代表性京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路。c 等高线图显示了 BPs 前五个基因集的富集结果。d 等高线图显示了 KEGG 通路前五个基因集的富集结果

识别与 IS 相关的 WGCNA 模块基因

WGCNA 被用于在综合数据集中识别与缺血性卒中（IS）密切相关基因簇。作者发现，在计算后当软阈值设为 22 时，拓扑网络的尺度独立性达到 0.85，并且邻接矩阵的平均连通性获得相对较高的值（图 3 a）。此外，作者使用层次树算法识别出五个共表达基因模块（图 3 b）。通过相关性分析将模块与疾病状态特征关联后，作者发现青色模块与 IS 的绝对相关性最高（图 3 c）。图 3 d 展示了青色模块成员与基因重要性的相关性分析，以及青色模块中 2157 个基因的相关系数；该图还显示 IS 基因的重要性为 0.69（P < 1e − 200）。

加权基因共表达网络分析。a 对不同软阈值功率的网络拓扑分析。b 基因的层次树算法。基因层次聚类树显示了网络和五个已识别的模块。c 模块-特征关联的热图。d 蓝绿色模块中模块成员与 IS 基因显著性的散点图

探索 DEM 的靶基因

总共，miRWalk 数据库预测了 10,849 个靶 mRNA 与上述 56 个 DEM 中的 14 个有结合位点。在这 14 个 DEM 中，8 个上调，6 个下调。作者将这些 10,849 个基因与 780 个 DEG 和 2157 个蓝绿色模块基因进行交集，保留 354 个交集基因作为与 IS 相关的关键基因进行进一步分析（图 4 a）。随后，这些 354 个交集基因用于构建 miRNA-mRNA 子网络（图 4 b 和 4c ）。

探索与缺血性中风相关的关键基因。a 差异表达 mRNA（DEGs）、青绿色模块基因和差异表达 miRNA 靶 mRNA 的交集的维恩图。b 上调 DEM 的 miRNA‒mRNA 亚网络。c 下调 DEM 的 miRNA‒mRNA 亚网络

功能富集分析

对 354 个交集基因进行了功能富集分析。BP 术语包括白细胞介导的免疫、白细胞活性的正向调控、适应性免疫反应、白细胞迁移以及参与不平衡免疫反应的白细胞激活。在细胞组分（CCs）方面，主要富集在外侧质膜、膜筏、膜微结构、细胞外基质、外部包被结构等。在分子功能（MF）术语方面，基因显著富集在细胞粘附分子结合、细胞因子受体结合、激酶调节活性、整合素结合、免疫受体活性等。前 10 项在星形条形图中显示（图5 a–5c）。富集的 KEGG 术语包括病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、NF-κB 信号通路、脂质与动脉粥样硬化、细胞因子-细胞因子受体相互作用。前 10 个 KEGG 通路在气泡图中显示（图 5 d）。功能富集分析的大部分结果与免疫和炎症反应相关。

基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析。a–c GO 功能富集分析结果的前 10 个术语，包括生物学过程、细胞组分和分子功能。d KEGG 通路分析的前 10 个结果

IS 生物标志物的筛选和诊断性能

为识别与缺血性卒中（IS）相关的特征基因，LASSO 回归分析从 354 个交集基因中筛选出六个基因进行后续研究，分别是 Tgfb1、Fc gamma 受体 2 b（Fcgr2b）、Vcan versican（Vcan）、白细胞免疫球蛋白样受体 B4（Lilrb4）、胆碱能受体，毒蕈碱 1（Chrm1）和类胰蛋白酶样弹性蛋白酶 1（Cela1）（图6 a 和 b）。受试者工作特征（ROC）曲线结果显示，这六个基因在训练集中的 ROC 曲线下面积（AUC）值均大于 0.9（图 7 ）。随后，对这三个验证集（ GSE97537 、 GSE97533 和 GSE66724 ）应用 ROC 曲线分析，以评估这六个基因的诊断价值（图 8 a–c）。最终，只有 Tgfb1 这一 mRNA 在所有验证集中的 AUC 值均大于 0.7。这些结果表明，Tgfb1 在区分大鼠和参与者的 IS 组与对照组方面具有良好的诊断性能。

通过最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归识别缺血性卒中的生物标志物。a LASSO 回归分析确定了与缺血性卒中相关的六个特征基因，其具有最小 lambda 值和非零参数。b 在元数据队列中，根据 log(lambda)序列生成了 LASSO 系数轮廓图。每条曲线对应每个基因的轨迹

训练集GSE36010 与 GSE78731 、 GSE61616 和 GSE106931 中特征缺血性卒中相关基因的受试者工作特征（ROC）曲线分析。ROC 曲线分析包括 a Tgfb1、b Fcgr2b、c Vcan、d Lilrb4、e Chrm1 和 f Cela1

验证集中文特征缺血性卒中相关基因的验证。这六个基因在 aGSE97537 、b GSE97533 和 c GSE66724 中的受试者工作特征曲线分析

MCAO 大鼠模型的验证

改良神经功能严重程度评分（mNSSs）在手术前两组相似（P > 0.05）。手术 1 天和 3 天后，MCAO 组的 mNSSs 高于对照组（P < 0.05）（图9 ）。为验证 MCAO 大鼠模型中 Tgfb1 mRNA 的表达水平，作者在再灌注 3 天后收集脑组织和血液组织。苏木精和伊红（H&E）染色和尼氏染色证实了模型的成功构建（图 10 a 和 b）。RNA 提取和定量实时聚合酶链反应（qRT‒PCR）结果显示，与对照组相比，MCAO 组的脑组织和血液组织中 Tgfb1 mRNA 显著增加（P < 0.05 和 P < 0.01，分别）（图 11 a–11b）。

术后不同时间的改良神经功能缺损评分（mNSSs），评分越高表示神经功能障碍越严重。ns 与对照组相比 P > 0.05；**与对照组相比 P < 0.01

脑组织代表性 H&E 染色和 Nissl 染色显微图（比例尺=1000 或 100 μm）。a 代表性 H&E 染色横切面。b 通过 Nissl 染色观察到两组脑组织中神经元的尼氏体。蓝色染色代表尼氏体，尼氏体颜色越深或呈斑纹状，神经元状态越好。苏木精和伊红（H&E）。**P < 0.05，与对照组比较

缺血性中风相关生物标志物的动物实验验证。a 大鼠脑组织中 Tgfb1 mRNA 的表达水平。b 中动脉闭塞（MCAO）组大鼠血液中 Tgfb1 的相对 mRNA 表达水平与对照组比较。*P < 0.05。**P < 0.01，与对照组比较

临床队列验证

接下来，作者通过 qRT‒PCR 验证了从缺血性卒中（IS）患者和健康对照（HCs）外周血样本中获取的 TGF-β1 mRNA 的表达。参与者的基本特征汇总于表 1 。这些 IS 患者和 HCs 在年龄或性别上没有显著差异（P > 0.05）。与生物信息学分析的趋势一致，qRT‒PCR 显示 IS 患者的血液中 TGF-β1 mRNA 表达高于 HCs 的血液（P < 0.001）（图 12 a）。TGF-β1 在临床样本中的 AUC 为 0.739（95%置信区间，0.590–0.888）（图 12 b）。

缺血性卒中（IS）相关生物标志物的临床实验验证。a IS 患者与健康对照组中 TGF-β1 的相对 mRNA 表达。**P < 0.01。b TGF-β1 表达的受试者工作特征曲线分析

TGF-β1 水平与功能结局之间的校正

使用改良 Rankin 量表（mRS）评分量化了缺血性卒中（IS）患者的功能结局。mRS 评分将 IS 患者分为功能良好组（mRS ≤ 2）和功能不良组（mRS > 2）。患者特征总结于表2 。功能良好组患者的 TGF-β1 水平显著高于功能不良组（P < 0.05）（图 13 a）。TGF-β1 水平与 mRS 评分呈负相关（r = − 0.442，P < 0.05）（图 13 b）。

TGF-β1 水平与改良 Rankin 量表（mRS）评分之间的关系。a 功能预后良好和功能预后不良患者的血液 TGF-β1 水平。*P < 0.05。b 使用 Spearman 线性相关分析 TGF-β1 水平与 mRS 评分之间的相关性。

总结

本研究中确定的枢纽基因 Tgfb1 在 MCAO 大鼠模型和临床缺血性卒中患者中均表现出稳定的表达模式。此外，越来越多的证据表明该枢纽基因与缺血性卒中有密切关联。值得注意的是，Tgfb1 对缺血性卒中显示出良好的诊断效果，并与疾病严重程度相关。这些发现突出了 Tgfb1 作为缺血性卒中诊断潜在生物标志物的可能性。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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