数据获取
从 GEO 下载 GSE65682（主队列）、GSE69528、GSE95233（验证）及 GSE217906（scRNA-seq）
经背景校正、分位数标准化后共 2805 个差异基因（|log2FC|>0.585，FDR<0.05）。
WGCNA 共表达网络
软阈值 β=10 构建无尺度网络， turquoise 模块与疾病状态相关性最强（r=-0.55，P=5×10⁻⁶⁴）。
CMGs 提取与交集分析
从 KEGG hsa04979 提取 156 个胆固醇代谢基因（CMGs），与 DEGs 及 turquoise 模块取交集，得到 4 个候选基因：VDAC1、VDAC2、LDLRAP1、LIPA。
机器学习筛选 Hub 基因
SVM-RFE + LASSO 双算法交叉验证。
最终保留 了3 个基因（VDAC1/VDAC2/LDLRAP1），多队列 ROC-AUC 达 0.972（内部）与 0.868/0.984（外部），SHAP 显示各基因贡献均衡。
单基因 GSEA & 免疫浸润
解析 Hub 基因相关通路及免疫微环境变化。
VDAC1/2 高表达富集核糖体、TCA 循环等代谢通路；LDLRAP1 与肠道免疫、Th17 分化相关；三基因均与多种免疫细胞浸润水平显著相关。
NMF 分子分型
依据 CMGs 表达将脓毒症患者分层，探索预后差异。
k=2 最优，分为 Cluster1（免疫抑制+代谢重编程）与 Cluster2；Cluster1 28 天生存显著差（log-rank P=0.014）。
机器学习预后模型
利用分型差异基因预测 28 天死亡风险。
集成 101 种算法，StepCox[both]+plsRcox 最优。
训练集 C-index=0.86，测试集=0.70；高低风险组生存曲线显著分离。
单细胞转录组分析
定位 Hub 基因表达及关键细胞亚群。
63 637 个细胞→25 群→10 大类；CD14⁺CD163⁺ 单核细胞在脓毒症显著扩增，伪时间分析处于终末分化位置，胆固醇代谢通路显著激活（NES=1.69，P=0.01）。
CellChat 细胞通讯
解析 CD14⁺CD163⁺ 亚群如何重塑免疫微环境。
该亚群与 T 细胞间通讯强度在脓毒症显著增强，主要配体-受体对涉及炎症与代谢调控。
SMR 孟德尔随机化
从eQTLGen数据库和GWAS数据库中获取基因组数据，检验 Hub 基因表达与脓毒症发病的因果性及药物靶点潜力。
仅 VDAC2 显著（β=-0.222，P=0.042，HEIDI=0.715），提示其高表达降低发病风险；无多效性证据，PheWAS 未见显著副表型，安全性良好。
统计与可视化
确保结果稳健可重复。
R 4.4.3 完成，双侧 P<0.05 为显著；多队列、多算法交叉验证降低过拟合风险。
