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中文标题：基于机器学习的单细胞和大量 RNA 序列鉴定的成纤维细胞特征和 CD8 + T 细胞 - 成纤维细胞亚型预测膀胱癌的预后和免疫治疗反应：生物信息学多组学研究研究背景
癌症相关成纤维细胞 （CAF） 存在于原发性和晚期肿瘤中。它们主要通过与肿瘤微环境中其他类型细胞的复杂机制参与肿瘤进展。然而，膀胱癌中必需的成纤维细胞相关基因 （FRG） 仍有待探索，并且缺乏理想的预测模型或分子亚型来评估膀胱癌的进展和免疫治疗评估，尤其是基于 FRG 的肌层浸润性膀胱癌。研究思路
通过分析单细胞 RNA 序列数据集鉴定膀胱癌的 CAF 相关基因，并使用大量转录组数据集和基因特征对其进行表征。然后，使用 10 种类型的机器学习算法来确定标志 FRG 并构建 FRG 指数 （FRGI） 和亚型。建立进一步的分子亚型结合 CD8 + T 细胞来预测预后和免疫治疗反应。研究结果
为探索膀胱癌TME的分期相关成分，研究对其单细胞RNA数据聚类并注释，发现免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞比例与T期相关，晚期更高。聚焦成纤维细胞，基于scRNA数据集GSE135337鉴定出相关基因，经TISCH验证，在另一BLCA scRNA-seq数据集及泛癌数据中，这些基因均在成纤维细胞簇高度富集，且膀胱癌中差异表达一致性率最高，部分在其他癌种也上调。相关性分析显示，这些基因多与成纤维细胞等基质特征正相关，与免疫细胞低相关或负相关，确认为成纤维细胞特征。PPI分析表明基因间相互作用密切，FN1可能为核心；共表达分析显示多数基因相关性高，少数较低。这些基因可作为成纤维细胞特征用于后续研究。差异分析显示，膀胱癌中多数成纤维细胞相关基因下调，仅SERPINH1和CTHRC1略上调，且主要在基质表达。功能上，这些基因富集于粘连斑等通路，涉及细胞外基质等功能，与细胞粘附、血管生成等相关。突变率低，仅COL6A3和FN1为5%-10%。IFITM3/2的CNV丢失与mRNA表达中等相关。甲基化方面，下调位点多与mRNA表达正相关，上调位点多负相关（位于启动子区域，可能沉默表达）。为评估成纤维细胞相关基因（FRG）的重要性和临床相关性：44.4%（24/54）为研究不足基因（PubTator得分<100），仅5.6%（3/54）有已批准药物靶向，79.63%尚无相关药物。基因依赖性评分（gDS）显示，仅IFITM3等少数基因在膀胱癌细胞中gDS较低，影响细胞活性，其中IFITM3在超50%人类癌细胞中为必需基因。临床相关性方面，单因素Cox分析显示多数FRG为膀胱癌总生存期高风险因素，高表达患者预后更差，且94.44%与分期相关、88.89%与分级相关，高表达伴随晚期和高分级。泛癌验证显示，在多种癌种中超50% FRG为预后危险因素。图3 FRG 的目标发育水平 （TDL）、基因依赖性评分 （gDS） 和临床相关性。为确定膀胱癌预后最相关基因，研究匹配FRG的mRNA表达与总生存期数据，经10种机器学习方法筛选，最终验证出CRYAB、FN1、COL6A1三个基因。通过多变量Cox回归，结合各基因系数和表达计算出FRG指数（FRGI），并在多个数据集验证其预后预测价值。 FRGI与膀胱癌晚期、高分级相关，高FRGI组化疗反应差、总生存期短、复发风险高，且在不同临床亚组中稳健有效。多变量Cox分析显示，FRGI在多数数据集为独立预后因素。基于此构建的列线图预测1-/3-/5年生存率准确率高，决策曲线分析显示临床获益显著，且FRGI的预后预测价值可扩展至其他癌种。
图4 FRG 指数 （FRGI） 和列线图模型构建。基于FRGI的意义，研究通过计算样本欧几里得距离生成成纤维细胞热型（高表达FRG特征）和冷型（低表达）。热型与肿瘤晚期、高分级相关，预后更差，且在多个队列中得到验证。对成纤维细胞亚型的膀胱癌基因组mRNA表达进行GSEA分析，发现热型中富集多种癌症相关通路，如TNFA/NFKB信号、KRAS信号、炎症反应等，且在5个数据集中普遍高富集。FRGI与这些通路高度正相关，与氧化磷酸化等通路负相关。此外，热型中原发性纤毛降解相关基因高表达，基底型、P53样亚型等分子亚型及免疫亚型C2多位于热型。
图5 FRG 亚型和机制
6.成纤维细胞类型与免疫治疗反应相关
鉴于成纤维细胞衍生基因与免疫相关细胞呈弱相关或负相关，研究进一步探究其对免疫治疗的影响。通过TIDE分析预测膀胱癌患者免疫治疗应答，发现无反应者多分布于高FRGI组或成纤维细胞热型，且FRGI预测免疫治疗反应的AUC达0.8642，无反应者FRGI更高，这一结果在多个膀胱癌数据集得到验证。转移性免疫治疗队列中，高FRGI组疾病稳定/进展患者比例更高；其他癌种（如黑色素瘤、非小细胞肺癌等）分析显示，高FRGI组预后差、免疫治疗反应不佳，小鼠队列中无反应者FRGI更高，AUC为0.6753。综上，成纤维细胞亚型及FRGI可预测膀胱癌免疫治疗反应，其评估价值还可扩展至其他癌种。
图6 FRGI 和 FRG 亚型预测免疫治疗反应。
7.CD8+T 细胞 - 成纤维细胞亚型构建、机制、表观遗传改变
研究进一步探究FRGI与膀胱癌免疫系统的关系，发现FRGI与多数免疫相关基因正相关，包括免疫抑制分子（如PDL1、PDL2），与VEGFB正相关、与VEGFA负相关。成纤维细胞热型的免疫评分、基质评分等更高，且免疫抑制细胞（Tregs、M2巨噬细胞）活性在热型和高FRGI组中高度激活，而抗肿瘤免疫细胞活性无显著差异，FRGI与Tregs等活性正相关，与CD4+T细胞等无相关或负相关。鉴于CD8+T细胞活性与预后稳定相关，将其与成纤维细胞亚型结合，构建4种CD8+T细胞-成纤维细胞亚型。其中CD8+FC型（高CD8+T细胞活性+成纤维细胞冷型）预后最好，CD8-FH型（低CD8+T细胞活性+成纤维细胞热型）预后最差，且在多个数据集得到验证。该分型能提高免疫治疗反应预测准确性，CD8+FC型患者反应率高，且可分析治疗中亚型迁移动态。 多组学分析显示各亚型基因特征、突变及拷贝数畸变不同，据此生成潜在治疗图谱，为膀胱癌亚型特异性联合治疗提供依据。
图7 CD8+T 细胞 - FRG 类型结构在预测预后和免疫治疗反应方面
。
图8 通过合并免疫微环境特征、通路特征和表观遗传特征以及原始潜在综合治疗策略，对与四种 CD8+ T 细胞 - FRG 亚型相关的特征的示意性描述。
研究结合基于机器学习的scRNA和批量RNA序列数据集，鉴定了3个潜在重要的成纤维细胞相关基因，并结合抗肿瘤免疫CD8+ T细胞进一步构建FRG亚型，以预测膀胱癌的预后和免疫治疗反应;我们希望这些有组织的数据能够用于进一步的临床试验和实验研究，以探索 FRG 治疗膀胱癌的实用性和潜在机制。别让繁琐的数据分析拖慢科研进度！西安科信服生物的专业团队，懂你所需、解你所难：转录组、单细胞、肠道菌群…… 无论哪个领域，机器学习、孟德尔随机化等工具信手拈来。从数据到结论，从思路到成果，一站式服务让你专注科学本身。现在就联系我们，让你的科研之路少走弯路，快速产出高质量成果，离顶刊更近一步！
