10+铜死亡+机器学习+细胞凋亡+单细胞+实验验证，基于热点结合机器学习的高分文章，顶呱呱！！

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导语

今天给同学们分享一篇文章“ Comprehensive analysis of cuproptosis-related genes involved in immune infiltration and their use in the diagnosis of hepatic ischemia-reperfusion injury: an experimental study ”，这篇文章发表在 Int J Surg 期刊上，影响因子10.1 。

结果：

差异表达基因（DE-CRGs）的鉴定和功能富集分析

在GSE151648 数据集中，共获得 2390 个差异表达基因（|log2（FC）| >0.6 且 P < 0.05），其中 591 个基因在 HIRI 组下调，1799 个基因上调（图 1 A）。通过整合 2390 个差异表达基因与 347 个癌症相关基因（CRGs），最终获得 19 个差异表达癌症相关基因（DE-CRGs）（图 1 B）。为研究这些差异表达基因在 HIRI 中的作用，我们进行了 GO/KEGG 富集通路分析。如图 1 C 所示，差异表达基因主要富集在炎症反应的调控、活性氧的响应、金属离子转运的调控、细胞因子/趋化因子活性和热休克蛋白结合中。此外，KEGG 结果显示细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、Th1 和 Th2 细胞分化、铁死亡和 HIF-1 信号通路富集（图 1 D）。

识别差异表达铜死亡相关基因（DE-CRGs）和功能富集分析。（A）与肝缺血再灌注损伤（HIRI）相关的差异表达基因（DEGs）的火山图。（B）DEGs 与 HIRI 中铜死亡相关基因（CRGs）的交集。（C）差异表达基因在生物学过程、细胞组分和分子功能方面的 GO 富集分析。（D）差异表达基因的 KEGG 通路分析。CRGs，铜死亡相关基因；DEGs，差异表达基因；DE-CRGs，差异表达的铜死亡相关基因；HIRI，肝缺血再灌注损伤。

通过机器学习识别特征 DE-CRGs

如上所述，HIRI 中有 19 个 DE-CRGs。为了识别 HIRI 的特征标志物，我们进行了 LASSO 分析，经过十倍交叉验证后，最佳 lambda 值为 0.0435。GNL3（鸟苷酸结合蛋白样 3）、ALAS1（氨基酮戊酸合成酶 1）、TSC22D2（转化生长因子β刺激克隆 22 结构域家族成员 2）、KLF5（Krüppel 样因子 5）、GTF2B（通用转录因子 IIB）、DNTTIP2（脱氧核苷酸转移酶末端相互作用蛋白 2）、SLFN11（schlafen 11）和 HNRNPU（异质性核糖核蛋白-U）的回归系数分别为 0.063、0.222、0.450、0.027、0.974、0.517、0.486 和 2.232（图 2 A, B）。这些系数的 95%置信区间和 p 值见。随后，我们分析了 8 个特征 DE-CRGs 之间的相关性，以探索铜死亡是否在 HIRI 的发展中发挥作用。结果表明，除 SLFN11 和 ALAS1 外，其余 8 个基因均高度相关。GNL3 和 DNTTIP2 之间的相关性最强（相关系数 0.84）（图 2 C）。热图和 8 个特征 DE-CRGs 的表达水平显示，它们在 HIRI 样本中的表达水平均显著高于非 HIRI 样本（图 2 D-E）。为预测 HIRI，分析了 8 个基因的 ROC 曲线。值得注意的是，DNTTIP2 和 HNRNPU 在 8 个基因中具有最高的曲线下面积（AUC），值为 0.962。GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B 和 SLFN11 的 AUC 值分别为 0.894、0.902、0.958、0.919、0.896 和 0.845（图 2 F）。我们开发了一个列线图，以进一步评估 HIRI 模型的预测效能（图 2 G）。校准曲线和临床决策曲线也表明，该线图准确且具有优异的净临床获益（图 2 H, I）。类似地，风险评分的 ROC-AUC 为 0.970，表明模型具有良好的区分能力（图 2 J）。总体而言，这些结果表明所有 8 个特征 DE-CRGs 均具有良好的诊断价值。

通过机器学习识别特征 DE-CRGs。(A, B) 使用 LASSO 回归构建特征 DE-CRGs。(C) 显示交集铜死亡基因之间关系的弦图。(D, E) HIRI 与非 HIRI 之间 8 个 DE-CRGs 的聚类热图和整体表达小提琴图。(F) HIRI 诊断中 8 个 DE-CRGs 的 ROC 曲线。(G) 基于 8 个基因预测 HIRI 风险的列线图模型。(H) 校准曲线的构建。(I) 显示列线图临床价值的决策曲线。(J) 预测 HIRI 的列线图校准曲线。DE-CRGs，差异表达铜死亡相关基因；HIRI，肝缺血再灌注损伤；ROC，受试者工作特征。****P< 0.0001，***P< 0.001。

8 个差异表达免疫相关基因的单基因富集分析

对 8 个差异表达细胞程序性死亡相关基因（DE-CRGs）在肝缺血再灌注损伤（HIRI）中的潜在机制进行了单基因 GSEA 分析（图3 ）。有趣的是，GNL3、ALAS1、TSC22D2、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU 与白介素信号相关，这些基因在 HIRI 中均上调。此外，GNL3、ALAS1 和 TSC22D2 上调的信号通路也与免疫系统中的细胞因子信号相关。然而，我们发现 TSC22D2、GTF2B 和 SLFN11 与细胞衰老呈负相关。ALAS1、TSC22D2、GTF2B 和 HNRNPU 分别与补体级联反应、程序性细胞死亡疾病、生物氧化以及促炎和促纤维化介质概述相关。因此，我们认为 DE-CRGs 与 HIRI 中的免疫反应、氧化应激和细胞死亡之间存在密切关系。

8 个差异表达铜死亡相关基因的单基因 GSEA 分析。对 GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU 进行通路 GSEA 分析。DE-CRGs，差异表达铜死亡相关基因；GSEA，基因集富集分析。

8 个差异表达相关基因（DE-CRGs）的免疫浸润和细胞死亡分析

GO/KEGG 分析显示，免疫反应、细胞凋亡和铁死亡似乎在肝缺血再灌注损伤（HIRI）中发挥作用。此外，在单基因 GSEA 分析中发现，8 个 DE-CRGs 与免疫通路和细胞死亡之间存在密切关系。为进一步验证 8 个 DE-CRGs 在 HIRI 中的作用，我们进行了免疫浸润和细胞死亡分析。

CIBERSORT 算法计算了每个 HIRI 和正常样本中 22 种免疫细胞的相对含量。热图显示了免疫浸润的标准化富集分数。此外，我们对 HIRI 组中的免疫细胞进行了相关性分析，发现活化的树突状细胞和活化的 NK 细胞之间的相关性最强。差异分析的结果显示，HIRI 组和非 HIRI 组有 5 种免疫细胞存在差异，即调节性 T 细胞、M0 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、静息肥大细胞和活化肥大细胞（图 4 A）。其他细胞的富集分析，补充数字内容 1 。M2 是炎症的抑制剂；然而，其在 HIRI 组中的含量下调。因此，我们进一步分析了细胞因子，包括 IL1B、IL-6 和 TNF。如图 4 B 所示，HIRI 组中 IL1B、IL-6 和 TNF 的水平高于非 HIRI 组。这些结果表明免疫反应在 HIRI 中发挥作用。随后，我们分析了免疫反应与 8 个差异表达免疫相关基因（DE-CRGs）之间的相关性（图 4 C ）。我们发现 GNL3 与 CD8 T 细胞、静息 NK 细胞和活化肥大细胞呈负相关。DNTTIP2 与 CD8 T 细胞、静息 NK 细胞、M2 巨噬细胞和活化肥大细胞呈负相关，而 KLF5 和 HNRNPU 分别与 M2 巨噬细胞和滤泡辅助 T 细胞呈负相关。然而，ALAS1 和 TSC22D2 分别与未成熟 B 细胞和活化记忆 CD4 T 细胞呈正相关。类似地，这 8 个 DE-CRGs 似乎与 IL1B、IL-6 和 TNF 呈负相关，但无统计学显著性。

8 个差异表达铜死亡相关基因（DE-CRGs）的免疫浸润和细胞死亡分析。(A) HIRI 组与非 HIRI 组之间免疫浸润的比较。(B) HIRI 组与非 HIRI 组之间细胞因子的比较。(C) 8 个 DE-CRGs 与免疫细胞的关联分析。(D) HIRI 组与非 HIRI 组之间细胞死亡的比较。(E) 8 个 DE-CRGs 与细胞死亡的关联分析。(F) 8 个 DE-CRGs 中显著免疫浸润和细胞死亡的分析。蓝线表示负相关关系，红线表示正相关关系。DE-CRGs，差异表达的铜死亡相关基因；HIRI，肝缺血再灌注损伤。****P<0.0001，**P<0.01，*P<0.05。

接下来，我们比较了 HIRI 组和非 HIRI 组之间细胞凋亡和铁死亡的差异。我们选择 MKI67 和 PCNA 作为细胞增殖的指标。选择 Caspase 9、FAS、bax 和 bcl-2 作为凋亡的指标，选择 ACSL4、PTGS2 和 FTH1 作为铁死亡的指标。结果表明，HIRI 组的细胞增殖减少，发生凋亡和铁死亡（如图 4 D 所示），这与先前的研究 28,29 结果一致。此外，我们发现 DNTTIP2 和 HNRNPU 与 PCNA 呈负相关，表明 DE-CRGs 抑制细胞增殖。此外，GNL3、DNTTIP2 和 HNRNPU 与 ACSL4 呈正相关，这表明铜死亡和铁死亡之间存在潜在的相互作用（如图 4 E 所示）。总之，我们在图 4 F 中构建了一个 CRGs-免疫细胞-细胞死亡相关网络，以说明上述发现。

HIRI 无监督聚类识别与分析

为解决 8 个 CR-DEG 是否能区分 HIRI 样本的问题，我们使用层次聚类算法识别出 23 个表达 8 个 CR-DEG 的 HIRI 样本。最终将 23 个 HIRI 样本分为两组，即 A 组（n=5）和 B 组（n=18）（图 5 A）。PCA 显示两组间存在显著差异（图 5 B）。两组差异分析显示，A 组中 ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2 和 HNRNPU 的表达水平低于 B 组（图 5 C）。此外，我们共鉴定出 2455 个 DEG（|log2 (FC) | >0 且 P < 0.05），火山图如图 5 D 所示。我们进行了 GO/KEGG 富集分析以探索两组间的特征。GO 分析结果显示 DEG 与自噬调控、凋亡信号通路调控、内质网应激反应以及巨噬细胞趋化性正向调控相关（图 5 E）。如图 5 F 所示，DEG 主要富集于 Ras 信号通路、TNF 信号通路、凋亡-多种物种以及铁死亡通路。

HIRI 无监督聚类识别与分析。(A)组 A 与组 B 间 8 个 DE-CRGs 的表达热图。(B)两组的主成分分析图。(C)组 A 与组 B 间 8 个 DE-CRGs 的表达小提琴图。(D)组 A 与组 B 间 DEGs 的火山图。(E, F)组 A 与组 B 间 DEGs 的 GO/KEGG 分析。HIRI，肝缺血再灌注损伤；DE-CRGs，差异表达的铜死亡相关基因；HIRI，肝缺血再灌注损伤。**P<0.01，*P<0.05。

初步验证 8 个差异表达免疫相关基因

最后，我们选择 GSE14951 来验证 8 个 DE-CRGs 在 HIRI 中的表达和诊断价值。与 GSE151648 试验基因集的结果相似，除了 SLFN11 外，HIRI 组的七个基因均高于非 HIRI 组（图 6 A）。所有 8 个 DE-CRGs 的对应 AUC 值均超过 0.86（图 6 B）。

8 个 DE-CRGs 的初步验证。(A)GSE14951 数据集中 HIRI 组与非 HIRI 组 8 个 DE-CRGs 的整体表达小提琴图。(B) GSE14951 数据集中 8 个 DE-CRGs 在 HIRI 诊断中的 ROC 曲线。(C) GSE171539 数据集中的 tSNE 图。(D) GSE171539 数据集中 HIRI 组与非 HIRI 组 8 个 DE-CRGs 的整体表达小提琴图。(E)假手术组和 HIRI 组小鼠及苏木精和伊红染色的整体图像。(F)假手术组和 HIRI 组血清 ALT 和 AST 水平。(G)假手术组和 HIRI 组 8 个基因的相对 mRNA 表达。DE-CRGs，差异表达的铜死亡相关基因；HIRI，肝缺血再灌注损伤；ROC，受试者工作特征。(每组 N=5) ****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

此外，从GSE171539 的 snRNA-seq 数据中选取了两个样本进行质量控制和数据标准化，并保留了 8841 个细胞用于分析。如图 6 C 所示，tSNE 图谱显示了九种细胞类型的注释，包括 NK/T 细胞、单核吞噬细胞、B 细胞、内皮细胞、浆细胞、甲状腺细胞、肝细胞、星状细胞和胆管细胞。根据所有簇的不同锚基因，肝细胞被注释为 SAA1。我们首先评估了 8 个基因的分布，发现 GNL3 和 GTF2B 主要在浆细胞中表达。TSC22D2 和 DNTTIP2 主要在内皮细胞中表达。KLF5 主要在胆管细胞中表达。HNRNPU 在除肝细胞外的所有细胞类型中广泛表达。此外，我们对 HIRI 和非 HIRI 进行了差异分析，发现 GNL3、KLF5、DNTTIP2 和 HNRNPU 在 HIRI 样本中的表达高于非 HIRI 样本。然而，ALAS1 和 GTF2B 在 HIRI 中的表达低于非 HIRI。 TSC22D2 和 SLFN11 没有显著差异（图 6 D）。当然，数据集仅包含 64 个肝细胞，这是肝脏中最大的细胞群体。因此，我们需要扩大样本量来支持上述结果。为了进一步验证我们的发现，我们建立了一个 HIRI 小鼠模型（图 6 E-F）。与我们的上述结果一致，与假手术组相比，HIRI 小鼠中七个基因（排除 SLFN11）的 mRNA 水平显著上调（图 6 G），表明 GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU 可能参与 HIRI。

为验证铜死亡的发生及其与凋亡在肝缺血再灌注损伤（HIRI）中的相互作用，我们向 HIRI 小鼠模型中添加了铜死亡诱导剂和抑制剂进行再次治疗。我们发现铜死亡抑制剂改善了肝损伤，而铜死亡诱导剂则表现出相反的效果（图 7 A-B）。进一步地，我们发现 HIRI 小鼠的铜含量增加，抑制剂和诱导剂的使用影响了铜含量（图 7 C-D）。此外，铜死亡抑制剂降低了 7 个基因的表达，而诱导剂则增加了表达（图 7 E）。最后，我们发现铜死亡抑制剂可以减少凋亡的发生，这证实了铜死亡与凋亡之间的相互作用（图 7 F）。综上所述，这些发现支持 8 个差异表达铜死亡相关基因（DE-CRGs）是 HIRI 中的关键参与者。

铜死亡的发生及其与 HIRI 中的细胞凋亡的相互作用。(A) 铜死亡诱导剂和抑制剂给药后小鼠的总体图像和苏木精和伊红染色。(B) 铜死亡诱导剂和抑制剂给药后血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。(C) 肝脏中的铜含量。(D) 肝脏中的铜罗丹明染色。(E) 8 个基因的相对 mRNA 表达。(F) 肝脏中的 TUNEL 染色。HIRI，肝缺血再灌注损伤。(每组 N=5) ***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

构建转录因子-DE-CRGs 网络和 miRNA-DE-CRGs 网络

为进一步探索 miRNAs/TFs 与 8 个 DE-CRGs 之间的复杂分子相互作用机制，我们构建了 miRNA-mRNA 和 TF-mRNA 网络关系图，如图 8 A-B 所示。TF-mRNA 复合物网络显示有 17 个 TF 可能调控 DE-CRGs 的 mRNA 表达。SLFN11 因其在 1 个数据库中的预测而被排除。POLR2A 和 CREB1 是发挥最主要调控作用的 TF。我们还预测了能够与 8 个 DE-CRGs 相互作用的 miRNAs。miRNA-DE-CRGs 相互作用网络共包含 192 个 miRNAs，其中 HNRNPU 分别与 SLFN11 和 DNTTIP2 共享 2 个和 4 个 miRNAs。而 GNL3 仅有一个 miRNA 与之相互作用。这 8 个 DE-CRGs 具有多个 TF 和 miRNA 的结合位点，这可为我们的进一步机制研究提供指导。

TF-DE-CRGs、miRNA-DE-CRGs 和药物相互作用的网络。(A) 8 个 DE-CRGs 的转录因子预测。(B) 8 个 DE-CRGs 的 miRNA 预测。(C) 8 个 DE-CRGs 的药物-基因相互作用预测。DE-CRGs，差异表达的铜死亡相关基因；TF，转录因子。

药物-基因相互作用预测

筛选出可能与 DE-CRGs 存在调控关系的 10 种药物，其中与 KLF5 相互作用的药物数量最多（图 8 C）。然而，我们最终获得了 3 种 DE-CRGs 的药物预测，包括 GNL3、KLF5 和 SLFN11。随着研究的深入，我们将获得更多药物预测。

总结

总之，我们通过一系列生物信息学分析筛选出与肝缺血再灌注损伤（HIRI）和铜死亡相关的八个特征基因（GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU）。此外，我们的研究显示差异表达细胞因子相关基因（DE-CRGs）与免疫浸润之间存在关联，以及 HIRI 患者亚组之间的异质性。基于这八个 DE-CRGs 构建的最优机器学习模型能够准确预测 HIRI 的发生风险并评估 HIRI 亚型。此外，我们构建了 miRNA/转录因子网络并预测了靶向药物。因此，我们的研究为 HIRI 的临床异质性和预后提供了新的见解，并为未来 HIRI 的潜在治疗提供了理论依据。。对这篇文章感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！

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